SN_T 3311-2012国境口岸甲型H1N1(2009)流感病毒的荧光定量PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3311--2012国境口岸甲型H1N1（2009）流感病毒的荧光定量PCR检测方法Detection method for influenza A 2009(H1N1)virus by real-time PCR atfrontier port2012-12-12 发布2013-07-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0保 SN/T 3311—2012前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：胡孔新、杨鹏飞、孙肖红、燕清丽、姚李四、杨宇、张丽萍。I SN/T 3311—2012国境口岸甲型H1N1（2009)流感病毒的荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸发现的具有发热或上呼吸道感染等疑似感染症状人员中甲型H1N1（2009）流感病毒检测的生物安全要求、样品采集、运输和保存，样品处理，核酸提取及快速检测方法。本标准适用于对国境口岸疑似感染人员携带甲型H1N1(2009)流感病毒的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS233-—2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3. 1甲型H1N1(2009)流感病毒|influenza Aβ009(HtN1)virus一种于2009 年 4月从墨西哥和美国病大体内分离得到新型病毒,该病毒属于正粘病毒科（Ortho-myxoviridae)流感病毒属 A型流感病毒。从基因组成来看，该病毒的基因组分来源于北美猪流感病毒、北美禽流感病毒、人类甲型流感H1N1亚型病毒和常见于亚洲欧洲的猪流感病毒。对于命名各国说法不一，该病毒爆发初期，常被称作猪流感另还有猪源流感人类猪(型)流感、墨西哥流感、北美流感、H1N1新型流感、新流感、以及 2009年H1N1流感。2009年 4月 30 日世界卫生组织将该病毒改称为甲型H1N1 流感病毒。本标准中将该病毒称为甲型 H1N1(2009)流感病毒。4检测对象国境口岸发现的具有发热或上呼吸道感染等疑似感染症状人员。5实验室生物安全要求5.1检测工作中的个人防护参照GB19489。5.2实验室应遵循GB19489和WS233一2002对生物安全2级（BSI-2)实验室的生物安全要求。5.3使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。1 SN/T 3311—20126 仪器设备与试剂6.1仪器设备需要以下仪器设备：超净工作台；二级生物安全柜；-微型混合器、涡旋振荡器；超低温冰箱（一80℃）；高速台式冷冻离心机；可调式微量加样器；荧光 PCR 检测仪（如LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000 型等）。6.2 试剂拭子病毒保存液:pH 7.4～7.6 的Hanks 液或 Earles平衡盐溶液，并含5%牛血清白蛋白，万古霉素 100 μg/mL，阿米卡星 30 μg/mL 和制霉菌素 40 U/ml。商品化系统如 BD Universal ViralCulturetteTM Transport System。1)7样品采集、保存与转运7.1样品采集将灭菌棉棒插人鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集粘膜表皮获得鼻拭子；将灭菌棉从口腔完全插人咽喉中，以咽后壁、上颚扁桃体的发红部位为中心，摩擦数次，采集粘膜表皮获得咽拭子（采集时，要注意不要触碰到唾液）。将棉棒头部浸人2mI采集液中，折断尾部弃去；对采集的样本进行编号登记。7.2样品的保存采集的新鲜的鼻（咽)拭子标本应保存在4℃条件下，24h内运送至实验室；未能24h内送至实验室的，应置一70℃或以下保存。7.3样品转运疑似人感染甲型H1N1（2009)流感病毒感染材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。8国境口岸甲型H1N1(2009)流感病毒的荧光定量PCR检测方法8.1甲型 H1N1(2009)流感病毒的核酸提取8.1.1核酸的提取采用天根生化科技有限公司TIANamp病毒RNA提取试剂盒进行或其他等效核酸提取方法，以下给出所提供试剂盒具体操作步骤案例，实际操作时按说明书进行。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。