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产油微藻的筛选及鉴定 随着岩浆岩能源的日益稀缺，作为一种可替代能源，生境源受到了广泛的关注。生物柴油因在能源密度、燃烧性能方面与化石柴油具有极高的相似性且具有环境友好、可再生等优点,而被认为是解决能源危机的最好替代能源之一。以提取法从油类作物、地沟油和动物脂肪中获得的生物柴油虽然具有众多优点,但是这些原料的来源十分有限,远不能满足人类社会发展的需要。 进行微藻的大规模培养被认为是解决生物柴油原料问题的最具潜力的途径。在过去的十多年里,美国、意大利、英国和日本等发达国家已相继开展微藻培养和生物柴油制备等工作,国内的中国科学院、清华大学、北京大学、中国海洋大学、新奥集团和中石化等一些机构也正在积极开展这方面的研究,能源微藻的研究炙手可热。 然而,现阶段进行微藻柴油的规模化生产,还存在许多技术瓶颈。要解决这些技术瓶颈需要折中和糅合微藻代谢调控及藻种筛选等各种因素。发展能源微藻项目的第一步无疑是解决藻种问题,筛选油脂高产藻种时,同时要注意微藻生长速度、对当地气候的适应能力以及在进行大规模培养时的经济效益等因素。 本文进行了产油微藻的分离和筛选方面的工作。从不同水域获取多份水样,建立了一套藻种分离方法,获得了多株产油微藻。研究了这些藻种在自养和异样条件下的产油情况,并对其中高产藻种进行了种类鉴定。 1 材料和方法 1.1 采样 本实验使用的水样采自江南大学校园内外几条污水沟及无锡太湖水域。采集水样用塑料瓶装好,带回实验室进行分离纯化。 1.2 藻种异养的培养 藻种的自养培养和分离纯化过程中采用BG11培养基;去除BG11培养基中的碳酸钠,加入15 g/L的葡萄糖作为藻种异养培养的培养基。培养基初始pH均调到6.5左右,添加2%的琼脂粉制备对应的固体培养基。 1.3 培养时间及培养温度 自养培养:以培养至对数生长期的藻液为种子培养液,以10%(V/V)接种量接种于BG11培养基中,置于光照强度为3600 lux、12h∶12h光照黑暗循环、培养温度23±1℃的光照培养箱中培养20 d。自养培养时每天摇晃培养液3~5次。 异养培养:以培养至对数生长期的藻液为种子培养液,以10%(V/V)接种量接种于添加葡萄糖作为唯一碳源的BG11培养基中,置于转速为150 r/min、温度为23±1℃、无光照的摇床中培养7 d。 1.4 单藻落的制备 将采集的水样先用纱布过滤除去大型颗粒物,滤液4000 r/min离心20 min。弃去上清液,加入10ml的BG11培养基,振荡使藻细胞悬浮,适当稀释后取0.1ml涂布于固体平板。培养20d后,用接种环挑出单藻落,将藻体转到装有2ml培养基的广口小试管中,于光照培养箱中培养。15 d后取长势良好的藻液进行多次平板涂布和划线纯化,最后将纯化的藻种进行保存。 1.5 藻株的初步鉴定 藻种形态观察与初步鉴定:用光学显微镜进行拍照观察,参照《中国淡水藻类——系统、分类和生态》进行藻株初步鉴定。 藻种分子生物学鉴定:将已分离纯化的单藻落平板,送到生工生物工程(上海)有限公司进行18s rDNA测序,将得到的结果提交Genbank中进行Blast序列比对,基于MEGA 软件进行多重序列分析,并构建系统发育树。 1.6 藻粉油脂提取方法 微藻生长曲线的测定:采用紫外可见分光光度仪测定藻悬液在680 nm处的吸光值(OD680)。 微藻生物量的测定:取4ml稳定期的藻悬液于已称重的5ml的离心管中,8000r/min离心5min,倒去上清液,蒸馏水振荡洗涤2次后倒去上清液,然后将藻体在60~80℃的烘箱中烘干至恒重。称重。 油脂提取方法:称取经低温冷冻干燥的藻粉0.3g,置于50ml的离心管中。加入8ml 4mol/L的HCl,振荡器振荡均匀后,静置35 min。然后沸水浴12 min,接着迅速放入-20℃冰箱中,冰冻10~30 min。取出离心管加入2倍体积氯仿甲醇(v/v,1∶1)提取剂,充分振荡,浸提20 min。接着4000 r/min 离心20 min后,取氯仿层(下层)于另一支离心管,加等体积的0.15% NaCl 溶液,4000 r/min 离心20 min取氯仿层(底层)于已称重的100ml的锥形瓶中。将瓶子放在60~80℃烘箱中烘至恒重。称重,计算油脂含量。 油脂含量的测定:油脂含量=(油脂质量/藻粉干重)×100% 单位时间和体积的油脂产率的计算公式如下: x=m1×n1?m0×n0tx=m1×n1-m0×n0t 公式中:m1为培养结束时藻体生物量,m0为接种时藻体生物量,n1为收获时藻体的油脂含量,n0为接种时油脂含量,t为培养时间,x代表油脂产率。 2 结果与分析 2.1 小球藻、小环藻、绿球藻和小球藻微藻的形态特征 从采集的水样中分离纯化出14株藻株,以微藻的显微照片及其生长特征为依据,参照《中国