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ph对眼点拟微绿球藻生长的影响 n-3是重要的生物活性物质，具有高的营养价值和多种保健功能。海洋微藻具有非常高的合成n-3长链多饱和脂肪酸的能力,日渐成为n-3长链多饱和脂肪酸的新来源。因此,有关利用微藻积累n-3长链多饱和脂肪酸的理论研究和开发应用倍受人们关注。 眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)是一种重要的海产经济微藻,其脂肪酸组成简单,富含EPA。目前,日本、澳大利亚等国家已实现了大规模养殖,国际市场供不应求。研究者发现在富含氮、磷的培养基中,该藻EPA的含量可以达到总脂肪酸的35%;眼点拟微绿球藻的总脂含量在稳定期含量最高,占干重的43.3%,在生长对数早期,EPA与总不饱和脂肪酸的比例最高,可达27.7%。而有关pH对该藻的影响规律少有报道。本文利用封闭式光合生物反应器研究了pH对该藻的生长、总脂含量及脂肪酸组成的影响规律,为更好地进行生态调控,提高EPA的含量提供了依据。 1 材料和方法 1.1 opyta和真眼点纲 藻种眼点拟微绿球藻属于金藻门(Chrysophyta),真眼点纲(Eustigmatophyceae)。藻细胞直径2~3μm。由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。 1.2 nano3的磷源、终浓度 实验中所用培养基为Provasoli的加富培养基,氮源为NaNO3,磷源为NaH2PO4·2H2O,氮、磷的终浓度分别为0.924 mmol/L、0.085 mmol/L,N/P比为10.85(M/M)。培养基均用无菌海水配制。 1.3 在线检测检测参数 实验中所用密闭式BFC-2光合生物反应器为烟台高新区海洋生物工程研究所生产。反应器罐体为柱状,径高比为1/3,实际体积为7 L,工作体积为6 L,培养过程中的各参数如温度、pH、转速、溶氧均能进行在线检测。实验前反应器空罐灭菌,121℃,20 min。 1.4 provaoli加富培养基 实验前离心收取藻液400~600 ml,将藻泥接种至2 L的玻璃三角瓶中,培养体积1 L,培养基为无菌海水配制的Provasoli加富培养基,培养至对数期。所用玻璃器皿均为高压蒸汽灭菌。 1.5 温度和转速以及光照强度a 将活化至对数期后期的藻种按1∶5的接种量接种于光合生物反应器中,起始OD680值为0.1左右。培养体积为6 L,温度为25±0.5℃,转速为150 r/min,光照强度为6400±200lx,光暗周期为12h∶12 h。分批培养中每天取样测定680 nm下的OD值及营养盐消耗情况。在不同的细胞时期收取藻液离心、洗涤,在离心收取藻泥后冷冻干燥,藻粉用于总脂和脂肪酸组成分析。实验重复两次,每次实验至少两个平行样,结果为平均值。 1.6 分析与计算 1.6.1 细胞浓度 根据回归方程y(106cell/ml)=36.883×OD680-0.1076,R2=0.85;由测得的OD680值,计算细胞浓度。 1.6.2 培养基中的营养盐消耗 1.6.3 分光光度法测定 藻体总脂占干重的百分比按Ahlgren 1991年的分光光度法测定,由(1)式可得分光光度法的总脂含量,由(2)式换算成重量法结果。 总脂(%干重,重量法)=6.782 3×总脂(%干重,光度法)+0.194 5 1.6.4 脂肪酸分析及检测 按Lepage1984年的方法并进行了改进。在螺口试管中称取15mg藻粉,加入1 ml被KOH饱和的CH3OH溶液,迅速混匀,于75℃水浴中皂化、甲酯化10 min,冷却至室温后加入约2 ml 1 mol/LHCl-CH3OH溶液使pH≤2,振荡1 min,在75℃水浴酸化10 min,冷却至室温,加入0.3 ml石油醚及少许蒸馏水促进分层,充分振荡,离心后取上层石油醚相进行色谱分析。 脂肪酸分析采用美国HP 5890II型气相色谱仪,氢火焰离子化检测器,SGEAC 20毛细管珠(30m×0.25 mm)。进样后程序升温:150℃保持1 min,以15℃/min升至200℃,再以2℃/min升至250℃。高纯氮为载气,流速1.5 ml/min,进样量为1μl。以面积归一化法得到各脂肪酸组分的相对百分含量。脂肪酸标样为Sigma公司产品。 2 结果 2.1 眼点拟微绿球藻的生长 pH对眼点拟微绿球藻生长的影响见图1。由图1可见,在pH为6.8,8.5,9.8的条件下,眼点拟微绿球藻具有大致相同的生长速率。在对数初期,该藻在pH6.8的条件下具有较高的生长速率;在对数后期,在pH8.5,9.8的条件下,眼点拟微绿球藻生长较快且细胞密度较高。在pH6.2的条件下,眼点拟微绿球藻的生长受到抑制,而在pH5.5的条件下,生长受到严重抑制。 由图2,3可见,在pH5.5,6.2的条件下,眼点拟微绿球藻的营养盐消耗受到抑制,因而其生长缓慢,