两种微藻生长时期对细胞内总脂含量和脂肪酸组成的影响.docxVIP

两种微藻生长时期对细胞内总脂含量和脂肪酸组成的影响 20碳五烯酸（epa）-是一种含有20%以上的长链脂肪酸-3（puf）。这对人类循环系统中的各种疾病具有显著疗效。它可用于治疗和预防动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、血栓形成和各种老年人疾病。作为人类的高级食品和药物，它越来越受到重视。EPA还能增强水产养殖动物的免疫系统功能,提高存活力和抗病能力,是水产饲料中的必需脂肪酸。虽然海洋鱼油是目前EPA的主要商业来源,但海洋微藻却是海洋多不饱和脂肪酸的初级生产者。开发富含EPA的海洋微藻的大规模培养技术,已被公认为替代鱼油生产EPA的最有效的新途径。 海洋微藻的总脂含量和脂肪酸组成,除了决定于微藻本身的遗传因素外,培养基组成(如氮、磷浓度和氮/磷比)、生长时期和环境条件(如光强、通气量、光/暗周期、温度等)因素都会极大地影响它们的生物合成和积累。一般来说,微藻中不饱和脂肪酸含量的降低是培养时间的函数;在高氮浓度下小球藻(Chlorellasp.)、紫球藻(Porphyridium cruentum)的PUFA含量增加;低的光照强度能促进PUFA的形成和积累。但是,海产三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornulum)中PUFA的含量(尤其是EPA)却在培养物老化时显著增加,稳定期达到最大值,而杜氏藻(Dunaliella bardawil和D.salina)在氮限制条件下才具有高的EPA含量;提高光照强度却能使小球藻(Chlorellasp.)和紫球藻(Porphyridium cruentum)中的EPA得以积累。因此,上述生态因素对不同藻种的影响变化很大,有些报道的结果甚至相反。 本文报道了海洋微藻后棘藻(Ellipsoidionsp.)和眼点拟微球藻(Nannochloropsis oculata)细胞生长时期对细胞总脂含量和脂肪酸组成的影响规律,为阐明EPA积累的优化生态条件,以及在优化生态条件下实现大规模培养提供了依据。 1 材料和方法 1.1 细胞生长7-14 后棘藻(Ellipsoidionsp.)是从美国加州大学引进的一种高脂的海产真核绿藻,细胞呈椭球形,直径2.5～3.5μm,只含有叶绿素a而不含有叶绿素b。本实验用的后棘藻7-14是本室从中筛选出的、富含EPA的优良藻株(结果尚未发表)。眼点拟微球藻(Nannochloropsis oculata)由中国水产科学院黄海水产研究所(青岛)提供。 1.2 培养基的制备 实验均采用消毒海水配制Provasoli培养基,所有玻璃器皿均在高压灭菌后使用。在500 mL三角瓶内,接种少量活化的藻液于300 mL培养基中,培养至对数期备用。 1.3 测定od值的方法 在无菌的250 mL三角瓶中,培养工作体积为100 mL,接种量为20%,使起始OD值达0.1～0.2。培养8d,每次各取2瓶为平行样。培养时光照强度87.0±16.5μmol·m-2·s-1,温度为22±1℃,光/暗周期为12/12h。取样后分别在460 nm(后棘藻)和680 nm(眼点拟微球藻)下测定培养液的OD值。藻液经离心收集、蒸馏水洗涤、再离心收集藻泥后冷冻干燥,藻粉用于总脂和脂肪酸分析。实验重复两次,结果为两次实验的平均值。 1.4 分析与计算 1.4.1 inx-inx1/t 微藻细胞的比生长速率μ按下式计算:μ=(InX2-InX1)/t。式中,μ为比生长速率(d-1),X1和X1分别实验开始和结束时的OD值,t为时间(d)。 1.4.2 微藻藻粉脂质测定 总脂占干重的百分比分别按重量法和分光光度法进行测定。为找出这两种方法的相关性以便换算,本试验预先采用了这两种方法,对眼点拟微球藻(本实验材料)、后棘藻7-14(本实验材料)、卡德藻(Tetraselmissp.)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis) 四种微藻藻粉的总脂进行了测定,得出了测定结果的相关性方程式(3)。正式实验中,先按分光光度法测定总脂,与亚油酸标准曲线式(1)对照可计算光度法的总脂含量式(2),再按式(3)换算成重量法结果。 A528nm=20.814×[亚油酸(mg)]-0.0753 (R2=0.9765) (1) 总脂(%干重,光度法)=[总脂(mg)/藻粉干重(mg)]×100% (2) 总脂(%干重,重量法)=6.7823×总脂(%干重,光度法)+0.1945 (R2=0.8565) (3) 1.4.3 脂肪酸组分的相对百分含量 按参考文献的方法并进行了部分改进。在螺口试管中称取约15 mg藻粉,加入1mL被KOH饱和的CH3OH溶液,迅速混匀,于75℃水浴中皂化、甲酯化10 min,冷却至室温后加入约2mL 1N HCl-CH3OH溶液使pH≤2,振荡1 m