第三章植物基因工程载体及其构建演示文稿.pptVIP

4、Ti质粒的改造 Ti质粒分子量过大，200kb左右，难以操作； 分布着各种限制酶的多个切点，难以找到可利用的单一限制性内切酶位点； T-DNA区Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，诱发肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）拷贝数少； Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的序列。 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍： 当前第63页\共有92页\编于星期三\8点 一元载体和双元载体 当前第64页\共有92页\编于星期三\8点 当前第65页\共有92页\编于星期三\8点 商业化T载体 一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。 自制T载体 一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下： 当前第31页\共有92页\编于星期三\8点 当前第32页\共有92页\编于星期三\8点 当前第33页\共有92页\编于星期三\8点 TOPO技术 拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。 TOPO克隆是一