蛋白A的固定最佳条件以及其抗体IgG纯化性能评价.docxVIP

蛋白A的固定最佳条件以及其性能评价 目的：以蛋白A作配基偶联活化的Sepharose4FF后用免疫蛋白IgG对固定后的蛋白A的性能进行验证并探究不同处理方式、不同上样方式对自制蛋白A亲和填料的利用效率，以确定最佳方案，有效提高IgG抗体的纯化。 方法：以环氧氯丙烷（ECH）活化凝胶，正交实验确定活化条件，以纯化数据确定抗体IgG纯化最佳缓冲液盐浓度，分别将抗IgG血清用不同处理方式、不同上样方式，不同上样速度进行亲和柱进行纯化，并收集纯化样品进行检测、分析，最终确定最佳方案。 1材料与方法1.1材料与仪器 重组蛋白A；Sepharose4FF；含有免疫抗体IgG的血清；环氧氯丙烷（ECH）；二甲基亚飒（DMSO）；硼氢化钠（NaBH4）；饱和硫酸铉（（NH3）2SO4）；磷酸盐缓冲液；0.1mol/LGly—Hcl缓冲液（pH2.8）；1mol/LTris-HCl缓冲液（pH9.0）；0.45〃m滤膜。 紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；电泳仪；冷冻离心机；Gene5酶标仪；SephaerylS-200HighResolution柱（S-200柱）。 1.2方法1.2.1蛋白A填料的制备 （1）制凝胶：取保存于20%乙醇水溶液中的Sepharose4FF介质5mL（沉降体积）用蒸馏水反复洗涤，除去乙醇后置入G3烧结玻璃漏斗真空抽干5min。取抽滤后的介质依次用20%，50%和70%(v/v)DMSO水溶液清洗，每次清洗后真空抽滤至干。向处理后的介质中依次加入70%(v/v)DMSO,ECH(终浓度15%,v/v),0.8mol/LNaOH和NaBH4水溶液(2mg/mL)，置40°C恒温空气浴摇床上振荡反应2h(170r/min)。反应结束后用大量去离子水冲洗直至清洗液中无环氧基检出。清洗液中环氧基采用硫代硫酸盐测定。以酚酞为指示剂，如清洗液变红表明有氢氧根离子生成，清洗液中存在游离的环氧基(清洗液用大量去离子水清洗后，若含有游离环氧基，能与硫代硫酸钠发生反应产生氢氧根离子)，需要再加去离子水冲洗至溶液不变色。 环氧基的鉴定：琼脂糖介质上的环氧基修饰密度用硫代硫酸钠滴定法测定。经去离子水清洗后的活化Sepharose4FF介质置入G3漏斗中真空抽干5min，随后称取0.5g置入磨口锥形瓶，并加入约3mL1.3mol/L硫代硫酸钠和酚酞指示剂1~2滴，锥形瓶封口后于室温下振荡反应30min。反应后的溶液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定直至溶液由红色变为无色。根据消耗的盐酸标准溶液的体积由下式计算环氧基修饰密度：S=%申。-匕)wP式子中S为环氧基修饰密度(mol/mL)，MHCl为HCl浓度(mol/L)，V。、V1为滴定前后HCl的体积(mL)，p为Sepharose4FF介质密度(1.02g/mL)，W为Sepharose4FF介质的质量(g)。 定义活化度为每1mL活化凝胶Sepharose4FF中含有的环氧基l口mol为一个活化度，也称作环氧基修饰密度(|Jmol/mL)。 蛋白A与凝胶的偶联：以pH7.5的硼酸-硼砂为缓冲液，加入SPA25(20mg)纯样品和活化后的琼脂糖凝胶Sepharose4FF1g，30^反应16h,抽干反应液，洗涤2次后再次真空抽干。用15mL0.2mol/L乙醇胺屏蔽未反应的环氧端基，于室温下反应5h。反应结束后，用去离子水清洗，然后用0.1mol/L含NaCl的磷酸缓冲液(pH7.4)和5倍体积去离子水冲洗并抽干，保存于4C,20%乙醇溶液中。 1.2.2抗体纯化 缓冲液的配制：平衡缓冲液：pH7.4,20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，分别含0.15、0.25、0.3、0.75mol/LNaCl)o洗脱缓冲液： pH2.8,0.1mol/L甘氨酸缓冲液。中和缓冲液：pH9.0,1mol/LTris-HCl缓冲液。以上缓冲液使用前均需经0.45以m滤膜过滤。 (样品先用平衡缓冲液稀释5-10倍，以保证样品液的pH和平衡缓冲液接近)。 1.2.3纯化样品 装柱：偶联了重组蛋白A的Sepharose4FF填料装柱内，使胶面平整，无沟流及气泡;，用洗脱缓冲液洗3~5个柱床体积洗掉乙醇和杂质，用平衡缓冲液流洗5~10个柱床体积平衡柱。连接紫外可见分光光度计在280nm波出调零 上样：将含免疫抗体IgG的兔血清样品上柱，均匀上样，可将流出液反复上样，以更好地结合IgG。 吸附：用平衡缓冲液再次平衡柱体，在A20处测定蛋白浓度，直到基线稳定(即杂蛋白完全洗脱)。 洗脱：分别以相对快速和慢速加入洗脱缓冲液，加入洗脱液，待吸光度上升至0?1以上时收集，吸光度下降至0?1以下停止收集，IgG从填料上洗脱下来，立即用上述中和缓冲液中和洗脱液至pH为中性，防止洗脱缓冲液的酸性环境引起抗体失活。待基线稳定后