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蛋白质分子定向进化其他方法 自然界在长期的进化过程中.产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。 自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计(rationaldesign)，但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化(moleculardirectedevolution)策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。 定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性(突变和/或重组)；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。 蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。每一步都可以有多种方法。 常见的定向进化方法有：①易错PCR技术②DNA改组技术③外显子改组④交错延伸重组⑤随机引物体外重组法(RPR)。当然还有其他的方法，下面就来给大家一一介绍。 一、随机诱变 ㈠化学诱变剂介导的随机诱变 体外随机诱变也可在65°C下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。 (二)由致突变菌株(mutatorstrain)产生随机突变 美国stratagene公司构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆菌突变株XLl-Red,它体内的DNA突变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒转化到XLl-Red菌株内复制过夜，在此过程中会产生随机突变。每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。 连续几代的随机突变和筛选的方法是从每一代中挑选出一个最佳的突变体作为下一代的亲本。通过积累氨基酸的正突变，可加快进化的进程。 ㈢定点突变和定点饱和突变技术 定点突变技术(Site—directedmutagenesis)一般用于对DNA分子特定位点的突变，所以需要预先知道野生型基因序列。早在1978年MichaelSmith就运用寡核苷酸进行定点突变。定点突变的基本原理是首先合成一段含有突变碱基的DNA引物，然后这段合成的引物可以杂交到包含有目的基因的单链DNA上，用DNA聚合酶将剩余片段进行延伸，得到的双链分子转入到宿主细胞并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变子筛选出来。定点突变技术有盒式诱变和多种基于PCR的突变方法，最常见的有重叠PCR等方法。当靶位点氨基酸分别可被其它19种氨基酸代替而得到突变子的方法，称为定点饱和突变技术，此方法是要着重寻求靶位点的最适氨基酸。定点突变和定点饱和突变技术的运用，能极大地丰富突变体库的多样性。 ㈣组合活性中心饱和突变试验 组合活性中心饱和试验(combinatorialactive,sitesaturationtest，CAST)的基本原理是：在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有潜在的协同作用。因此，突变后才可能获得更具有潜力的突变体。这是单点突变不能做到的。如果选择的氨基酸对应的位置是1，则第2个氨基酸的选择遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在。折叠上则选择第n+2位，若在3顶螺旋上，则选择第n+3位；若在a螺旋上，则选择第n+4位。对于CAST突变体库容量的计算：每突变一对氨基酸要进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突变成20种氨基酸的任何一种。以NNK(N代表任何一种核苷酸，K代表是G或T)作为突变的碱基形式，则有322=1024种不同的组合，而氨基酸则可突变成202=400种不同的组合。因此，要将每个库的所有突变的覆盖率达到95%，则每个库至少要挑3000个克隆子。 此外，近年来还发