DB35T 1992-2021番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量 PCR 鉴别诊断技术.docxVIP

ICS 65.020 CCS B 40 福 建 省 地 35 方 标 准 DB35/T 1992—2021 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光 定量 PCR 鉴别诊断技术 Diagnostic technique of duplex real-time fluorescent PCR for the detection of muscovy duck parvovirus and goose parvovirus 2021 - 08 - 17 发布 2021 - 11 - 17 实施 福建省市场监督管理局 发 布 I DB35/T 1992—2021 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 原理 1 5 试剂与材料 2 6 仪器设备及耗材 2 7 操作方法 2 8 结果判定 3 附录 A(规范性) 0.01 mol/L (pH 7.2)磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 5 附录 B(规范性) MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测方法所用引物 6 附录 C(规范性) MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测反应体系组分 7 附录 D(资料性) MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测标准扩增曲线 8 附录 E(资料性) MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测融解曲线 9 II DB35/T 1992—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所。 本文件主要起草人：林甦、王劭、陈少莺、陈秀琴、黄梅清、程晓霞、肖世峰、陈仕龙、林锋强。 1 DB35/T 1992—2021 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量 PCR 鉴别诊断技术 1 范围 本文件规定了鉴别检测番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)和鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)双重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法的原 理、试剂与材料、仪器设备及耗材、操作方法、结果判定。 本文件适用于番鸭细小病毒、鹅细小病毒的核酸检测和鉴别。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。 融解(解链)温度 melting temperature； Tm 值 核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现 象和结晶的融解相类似，又称融解温度。 注： 基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。 4 原理 MDPV与GPV全基因序列在核苷酸水平上同源性约为81.9%。基于两种水禽细小病毒基因核苷酸序列上 的差异，分别设计两对特异性PCR引物，分别扩增两种病毒VP基因序列上的一段300 bp左右特异性片段， 并在PCR 反应体系 中加入过量双链 嵌合荧 光染料，荧 光染料非特 异性地掺入 脱氧 核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid， DNA) 双链后发射荧光信号， 而不掺入链中的荧光染料分子不会发射任何荧 光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，呈现正向对应关系。当PCR反应结束后， 通过重新加热扩增产物(反应温度逐渐升高) ，使结合了荧光染料分子的双链DNA解离或“融解”成单 链DNA，荧光强度发生显著变化，形成一幅融解曲线图。由于上述两个特异性片段的Tm值不同，造成不 同的PCR产物融解曲线特性不一样(出现峰值所对应的温度不同)，通过分析扩增后融解曲线，可以简 单、直接地判断实时荧光定量PCR反应产物的目的基因片段，以此来鉴别MDPV和GPV。 2