影响右旋糖酐比旋度因素的研究.docx

? ? 影响右旋糖酐比旋度因素的研究 ? ? 慕 娟，问清江，郑巧霞，孙晓宇，丁 浩 ( 陕西省微生物研究所， 陕西 西安 710043) 右旋糖酐(Dextran)是主要由葡萄糖α-1,6糖苷键连接而成的葡聚糖[1]，具有增加血容量、改善微循环、防止弥散性血管内凝血的作用，主要用于治疗失血性休克，是目前公认的优良血浆代用品之一。临床上应用的常有3种规格产品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐的生产原理：蔗糖经肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)产生的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase；E.C.2.4.1.5)合成右旋糖酐(粗酐)，粗酐进一步水解、分离纯化为药品右旋糖酐[2～3]。一切糖类都有不对称碳原子，所以都具有旋光性，旋光性是鉴定糖的一个重要指标[4]。偏振光透过长1 dm且1 mL中含有旋光物质1 g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度。测定的比旋度可以区别和检查物质的纯杂度程度，亦可以用以测定含量[5]。比旋度可以衡量右旋糖酐的纯度，是产品质量标准中的一个重要指标。右旋糖酐的生产过程中所涉及到的糖主要有右旋糖酐、蔗糖、果糖和葡萄糖，它们都有各自的比旋度(表1)。我国右旋糖酐产品的比旋度和日本、欧美等国家存在差异(表2)，这不仅仅是数据的差异，实质是产品纯度的差别，单从比旋度这一指标来看，我国右旋糖酐产品纯度低于其他国家。在右旋糖酐生产过程中，蔗糖是发酵的主要原料，果糖是产量大于右旋糖酐的主要发酵产物，葡萄糖主要产生于右旋糖酐的水解，这三者是右旋糖酐生产过程中需要去除的主要糖类杂质，它们的残存影响右旋糖酐的质量，通过比旋度可以表现出来。因此右旋糖酐的比旋度不仅是产品的质量指标，而且要作为工艺过程中的考察指标，将其影响因素作为研究对象，既可以改进生产工艺，又可提高产品质量。以右旋糖酐40作为对象，分别以粗酐、发酵液和膜处理发酵液为原料，采取盐酸水解和右旋糖酐酶酶解制备右旋糖酐40，采用乙醇分离纯化和膜分离纯化两种不同方法从水解液中分离右旋糖酐40，对工艺过程和产品的比旋度进行检测分析，从而探究对右旋糖酐40比旋度的影响因素。 表1 右旋糖酐生产过程中所涉及糖在20℃(钠光)时的比旋度[4] 表2 不同国家右旋糖酐40比旋度[5～7] 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 葡萄糖(D-(+)-Glucose), 果糖(D-(-)-Fructoes),Sigma 公司产品；蔗糖(AR)；其他试剂为市售分析纯。 1.1.2 粗酐 陕西省微生物研究所自制。 1.1.3 仪器 WZZ-2S自动旋光仪(上海光学仪器五厂有限公司)；85-2数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)； 2010A-HT高效液相色谱仪(苏州贝锐仪器科技有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 粗酐水解制备右旋糖酐40 粗酐浓度6%，盐酸0.1%，温度95℃，水解时间2.5 h，水解结束按照1%加入粉末活性炭，95℃搅拌保温40min，过滤收集滤液，乙醇分级纯化分离右旋糖酐40。 1.2.2 发酵液水解制备右旋糖酐40 按照盐酸0.16%，温度95℃，水解时间3.5 h水解右旋糖酐发酵液，水解结束按照1%加入粉末活性炭，95℃搅拌保温40min，过滤收集滤液，乙醇分级纯化分离右旋糖酐40。 1.2.3 膜处理发酵液水解制备右旋糖酐40 发酵液经板框过滤，陶瓷膜微滤，滤过液经5 000膜超滤分理去除果糖等小分子，超滤截留液为发酵液处理液；在盐酸浓度0.08%，水解时间3.0h，温度95℃条件下水解；水解结束按照1%加入粉末活性炭，95℃搅拌保温40 min，过滤收集滤液；滤液经过5 000，10 000，20 000，50 000和100 000超滤膜多种组合分离右旋糖酐40。 1.2.4 比旋度测定[5]精密称取样品，加水溶解并定量稀释成每1 mL中约含10 mg的溶液，在25℃时，依法测定比旋度(通则0621)。 1.2.5 分子量与分子量分布[5]取样品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜作为供试品溶液。另取4～5个已知分子量的右旋糖酐对照品，依法检查(通则0514)。 2 结果与分析 2.1 乙醇浓度对右旋糖酐比旋度的影响 粗酐经过盐酸水解，活性炭吸附除杂，过滤收集滤液按照43.5%加入乙醇，搅拌均匀，40℃保温20 h，倾出上清液，弃去沉淀。上清液分别以52%，53%，54%，55%，56%不同浓度继续加入乙醇，室温放置24 h，倾出上清液，收集沉淀，干燥取样检测比旋度(表3)。 表3 乙醇浓度对右旋糖酐比旋度的影响(1) 粗酐经过右旋糖酐酶酶解，活性炭吸附除杂，过滤收集滤液，分别54