实验质粒提取和鉴定.pptVIP

;目的;;质粒DNA的提取方法;选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求;碱裂解法; 2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）;3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 ;原理示意图;;限制性核酸内切酶分类;Ⅱ型限制与修饰系统;实验质粒提取和鉴定;酶切反应中应注意以下几个问题： ;;反应缓冲液：;;三 质粒提取实验材料与试剂 ;;四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增;步骤二 质粒提取;5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。;;双酶切实验材料;方法和步骤;2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应2~3小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 5. 取20μl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min 加入5μl未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。;五 实验结果;凝胶成像结果;六．注意事项 ; 七．思考题;;目的;;质粒DNA的提取方法;选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求;碱裂解法; 2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）;3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 ;原理示意图;;限制性核酸内切酶分类;Ⅱ型限制与修饰系统;实验质粒提取和鉴定;酶切反应中应注意以下几个问题： ;;反应缓冲液：;;三 质粒提取实验材料与试剂 ;;四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增;步骤二 质粒提取;5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。;;双酶切实验材料;方法和步骤;2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应2~3小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 5. 取20μl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min 加入5μl未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余