疾病相关基因的发现及功能研究演示文稿.pptVIP

RACE PCR产物的克隆及酶切鉴定 按照常规方法进行凝胶回收 与T载体的连接 重组质粒的转化 重组质粒DNA的抽提及酶切鉴定(见图17) Fig 17 TA subclone and Identify positive clones by restricated enzyme EcoR I digestion. Lane 1,2,3,4: The plasmid were not digested by EcoR I. Lane M: Marker. Lane 5, 6,7,8: The lane1 and lane2 plasmids were digested by EcoR I. 当前第63页\共有91页\编于星期一\7点 第一轮测序图谱 Fig 18 Sequence results of product from first 5’RACE 当前第64页\共有91页\编于星期一\7点 Gene function analysis Over expression RNAi Tissue distribution Sub-cell location Knock out Transgene In vitro analysis In vivo analysis Immunohistology Confocal Microscopy 当前第31页\共有91页\编于星期一\7点 优 点 同其他方法相比较 微量样品：仅需0.2μg总RNA作为起始材料 高通量：可同时分析多组样品 敏感性：高, 可检出低丰度mRNA 实验周期： 短, 约8天即可完成, 便于重复 脚踏实地：步步验证比较 可简单地将DD的特点概括为“3SRV”,即“Simplicity, Sensitivity, Speed, Reproducibility, Versatility” 当前第32页\共有91页\编于星期一\7点 同其他方法相比较 一是假阳性多(约50 %～70 %) 二是得到的有差异cDNA片段短 (约为110～500 bp) 缺 点 当前第33页\共有91页\编于星期一\7点 假阳性的原因 提取总RNA时, 有染色体DNA污染,此DNA作为模板在PCR过程中被扩增 从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时,实验组与对照组间信号对比不够显著 在克隆阶段挑选阳性菌落时,未能排除基因克隆中的假阳性 研究中多次使用PCR技术,很难避免实验室环境中的交叉污染 当前第34页\共有91页\编于星期一\7点 解决方法 提取RNA操作严格,得到的RNA 必须经过脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化, 去除染色体DNA污染 切取有差异条带时,首选实验与对照间信号差异显者,最好是互为有或无的关系; 仅仅是强与弱的关系, 放在次选位置上 即使是差异显著地显现为一条带,也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳动而成, 有可能是结构不同而分子量相同的cDNA共泳动的结果 交叉污染问题的克服应服从分子生物学一般原则 金标准：差异基因最终确认用Northern杂交 当前第35页\共有91页\编于星期一\7点 其它方法 基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE) DNA芯片(DNA Chips) 几种方法的综合运用 当前第36页\共有91页\编于星期一\7点 翻译水平差异表达研究策略 当前第37页\共有91页\编于星期一\7点 蛋白质水平分析 蛋白质组学：一个蛋白质组是由一个基因组或任何细胞／组织表达的所有种类蛋白质 同一种mRNA可因不同的剪接或翻译后加工产生多种蛋白质，故一个蛋白质组的蛋白质数量可超过相应基因组的基因数目 当前第38页\共有91页\编于星期一\7点 蛋白质组学研究常用技术 二维凝胶作图(2D—gel mapping) ：二维凝胶作图是在同一块凝胶上，一个面上依据蛋白质的等电点(pI)，另一面上依据蛋白质的分子量进行电泳，将各种不同蛋白质分开，这种方法可同时分析数千种蛋白质 凝胶的高分辨率和高度重复是运用二维凝胶电泳分离许多种复杂蛋白质混合物的前提 当前第39页\共有91页\编于星期一\7点 二维凝胶作图方法 2种方法： 垂直平板凝胶(vertical slab gels) 超薄水平凝胶(ultra-thinhorizontalgels) 均采用梯度凝胶(9-16％聚丙烯酰胺)，可分离5--200kD蛋白 当前第40页\共有91页\编于星期一\7点 检 测 根据实验目标和所需灵敏度采用银染、考马氏亮蓝或放射自显影检测 采用激光密度扫描(laser