质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.pdfVIP

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定之巴公井开创作 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操纵方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步调， 在体外（缓冲液中）复 n 制 DNA，使目的DNA 按 2 方式呈指数形式扩增。 PCR 一次循环的具体反应步调为： A.变性：加热反应系统至 95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解 链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于 模板 Tm 值 的 5℃左右 ），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温 72℃，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原 料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一 条双链。 (1).碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差别： A.高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性； B.当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并保管 在溶液中，染色体 DNA 不克不及复性而形成缠连的网状结构，可通过离 心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA， 而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会发生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选 择性； B.各种分歧的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应 DNA 的纯度； A260/A280=1.8 DNA 纯净 A260/A2801.8 暗示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A2801.8 含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切鉴定： 限制性内切酶是 DNA 重组操纵过程中所使用的基本工具。限制性内切酶 能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与 其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链 DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔 径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：分歧的 DNA，分子量大小及构型分歧，电泳时的泳动率就分歧，从而分出分歧 的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、资料与方法： （一）实验资料： 仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 资料：菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光 蛋白 GFP)】、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物 2. 质粒 DNA 的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加 样枪、离心管 资料：溶液 P1 （S1）、溶液 P2 (S2）、溶液 P3 （S3）、去蛋白液 PE （W1）漂洗液 WB （W2）、洗脱液 EB （Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠 杆菌 DH5 α 3. 质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法） 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 资料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 仪器：1.5ml 的EP 管、微量加样枪 资料 ：无菌水 、10×M 酶切缓冲液 Buf R 、质粒 DNA 、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 资料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳