DB37T 4362—2021流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS 11.220 CCS B 41 37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 4362—2021 流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光 RT-PCR 检 测方法 Duplex real-time RT-PCR detection method for influenzavirus and canine distemper virus 2021 - 03 - 11 发布 2021 - 04 - 11 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分： 标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、威海市畜牧 业发展中心、山东省畜牧总站、青岛市动物疫病预防控制中心、淄博市张店区畜牧事业服务中心、山东 农业大学。 本文件主要起草人：王贵升、张鹤晓、赵国清、尹斐斐、徐鸿、宋德武、薛瑞雪、李玉杰、杨景晁、 孙淑红、马慧玲、张华杰、兰邹然。 流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了水貂、狐狸和貉流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法。 本文件适用于水貂、狐狸和貉流感病毒与犬瘟热病毒的快速鉴别诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应 RNA：核糖核酸 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水 5 试剂或材料 5.1 除非另有说明， 在检测中使用的试剂均为分析纯， 水应符合 GB/T 6682 要求。所用液体试剂均需 使用无 RNA 酶的容器进行分装。 5.2 TRIzol，应 2 ℃~8 ℃保存。 5.3 0.1 % DEPC 水。 5.4 氯仿， 4 ℃预冷。 5.5 异丙醇，4 ℃预冷。 5.6 75 % 乙醇，配置见 A.3，应-20 ℃预冷。 5.7 TE 缓冲液，配制见 A.4。 5.8 阳性、阴性对照。 —— 阳性对照： 带有流感病毒 M 基因和犬瘟热病毒 N 基因的质粒。 —— 阴性对照： 为已知流感病毒和犬瘟热病毒阴性的动物组织悬液。 6 仪器设备 6.1 双通道以上荧光 PCR 检测仪及配套反应管（板）。 6.2 高速冷冻离心机，最高转速应不低于 13 000 r/min。 6.3 冰箱， 2 ℃~8 ℃ 和-20 ℃两种。 6.4 微量移液器及配套吸头， 量程规格应包含 5 μL、10 μL、100 μL 和 1 000 μL。 6.5 1.5 mL 离心管， 应无核酸酶。 7 样品 7.1 采样工具 下列采样工具必须经121 ℃, 15 min高压灭菌并烘干： ——棉拭子； ——剪刀、镊子； —— 1.5 mL 离心管； ——研钵或组织研磨仪。 7.2 样品采集 7.2.1 拭子样品 有咽喉拭子样品和肛门拭子样品： a) 咽喉拭子采样，采样时将拭子深入喉头来回刮 3 次～5 次取咽喉分泌液。然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS 的 1.5 mL 离心管中， 加盖、编号备用； b) 肛门拭子采样，采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便； 然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS 的 1.5 mL 离心管中， 加盖、编号备用。 7.2.2 组织样品 用无菌剪刀、镊子采集不少于2.0 g的肺脏等组织脏器，装入一次性自封袋或其它灭菌容器，编号 备用。 7.3 样品贮运 样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品， 放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封， 24 h内送实验室。 7.4 样品处理 7.4.1 拭子样品 样品在混匀器上充分混匀后， 用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转 入无菌的离心管中， 编号备用。 7.4.2 组织样品 取待检样品，不少于2.0 g，用洁净、灭菌并烘干的研钵充分研磨，加10 mL PBS混匀，4 ℃, 3 000 r/min 离心15 min，取上清液转入无菌的1.5