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电针治疗慢性疲劳综合征的机制研究 慢性疲劳综合征（cps）与神经外皮神经过渡功能异常密切相关。cps患者的下肢-体育-肾上腺轴（hyp-a）功能异常。电针和足三里可显著减轻cfs患者的临床症状，提高生活质量。此外，它对cps患者异常的hpa功能也有很好的调整。本研究以复合型慢性疲劳大鼠为研究对象,采用侧脑室注射促肾上腺皮质激素释放因子、促肾上腺皮质激素释放因子拮抗剂工具药的方法,检测下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素(corticotrophin releasing hormone,CRH)表达水平以及血浆促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone,ACTH)及皮质酮(corticosterone,CORT)含量,进一步揭示电针调整慢性疲劳大鼠HPAA异常的中枢机制。 1 材料和方法 1.1 :24-19:24暗置电 清洁级SD大鼠96只,体质量(191.76±10.70)g,雌雄兼用,由成都达硕动物科技有限公司提供[许可证号:SCXK(川)2008-24]。雌雄分笼,5只/笼。室温(20±1)℃,湿度60%~70%,7:00-19:00光照,19:00-次日7:00暗置。适应性喂养1周后按体质量编号,随机分为空白组、模型组、模针组、侧脑室假注射组(假注射组)、侧脑室注射促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin Releasing Factor,CRF)组(CRF组)、侧脑室注射促肾上腺皮质激素释放因子电针组(CRF电针组)、侧脑室注射促肾上腺皮质激素释放因子拮抗剂(corticotropin releasing factor antagonist,CRFA)组(CRFA组)、侧脑室注射促肾上腺皮质激素释放因子拮抗剂电针组(CRFA电针组),每组12只。 1.2 大鼠acth、cort酶联反应分析试验剂盒 CRF:美国sigma公司生产(批号:019K4758),以蒸馏水稀释,浓度为0.1 mg/mL。CRFA:美国sigma公司生产(批号:116K4807),以蒸馏水稀释,浓度为0.1mg/mL。大鼠ACTH、CORT酶联反应分析试剂盒:美国RD公司进口分装(批号。CRH一抗:武汉博士德生物工程有限公司(批号。免疫组化通用试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司(批号。 1.3 慢性疲劳大鼠模型 除空白组大鼠常规饲养,其余各组大鼠均采用白天强制冷水游泳和夜间慢性束缚的方法建立复合型慢性疲劳大鼠模型。白天不定时强制大鼠进行冷水游泳9min,水温(10±1)℃。晚上将大鼠放入束缚筒(长26cm,内径5.5cm)内进行束缚,每日束缚开始时间不确定,每天持续3h。造模共持续9d。 1.4 crf抗剂单次注射建立 造模后假注射组、CRF组、CRF电针组、CRFA组、CRFA电针组进行侧脑室注射。10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3mL/1kg体质量),将大鼠头部固定于脑立体定位仪,根据大鼠颅脑立体定位图谱定位左侧侧脑室颅骨投影位置(微量注射针末端位置B:-0.8,L:1.5)。CRF组、CRF电针组大鼠侧脑室注射CRF 7.5μL,1min注射完后保持1min再出针。CRFA组、CRFA电针组大鼠以相同方法注射CRF拮抗剂7.5μL。侧脑室假注射组仅插入微量注射针,但不注射药物,留针2min。 1.5 电针治疗 对模针组、CRF电针组、CRFA电针组进行电针治疗。已有研究显示,正常大鼠CORT分泌的峰相位为-9.05°,对应于夜间0:30,因此每日0:30进行电针治疗,连续治疗3d。 (1)取穴:“足三里”,对应大鼠的“后三里”,位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处,胫、腓骨间隙中。“肾俞”,对应大鼠第2腰椎棘突下旁开7mm处。 (2)操作:以0.25mm×13mm一次性针灸针垂直进针,“肾俞”进针4mm、“后三里”进针7mm,进针后连接G6805-2型电针治疗仪,同侧“肾俞”“后三里”为一组电极,疏密波,强度以大鼠下肢肌肉轻微抽动为度,电针治疗20min。 1.6 sabc法 治疗后以10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,采血3mL于抗凝管中,静置20 min后离心20 min(3000r/min),取上清液,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测血浆中ACTH和CORT的含量。采血后断头取脑组织固定,在距视交叉1 mm处冠状切取脑组织约5 mm长,石蜡包埋,冠状连续切片,片厚6~8μm,以免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法)常规染色,主要步骤如下:脱蜡、水化后以磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,每次5min;以PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5 min,蒸馏水洗3次后PBS洗5min;滴加正常山羊血清封闭液,室