冠心病不稳定型心绞痛血瘀证血浆差异蛋白组学研究.docxVIP

冠心病不稳定型心绞痛血瘀证血浆差异蛋白组学研究 非稳定型心绞痛（iup）是冠状动脉粥样硬化最常见的类型，也是心血管疾病最常见的综合征之一。aep的预防和治疗已成为临床难题之一。血瘀证是心绞痛中常见的中医证候表现。心绞痛的发病机制现仍然不完全清楚,尚无早期诊断的特异性标志物。近年来蛋白质组学技术的飞速发展,为研究心绞痛的发病机制和探索早期诊断的生物标志物提供了新的思路和技术平台。冠心病心绞痛发生过程中,人体器官病理变化的产物可释放入血,导致血浆蛋白在结构和数量上的改变,因此,研究心绞痛状态时的人体血浆蛋白质组变化有着非常重要的意义。本研究采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术发现心绞痛血瘀证患者和健康对照组人群血浆水平的确存在差异,为了寻找更多的差异蛋白,现采用Agilent抗体柱去除血浆中的高丰度蛋白后,再进一步行双向凝胶电泳分析。 1 对象和方法 1.1 中医诊断标准 6例冠心病不稳定型心绞痛痰瘀互阻证、9例冠心病不稳定型心绞痛气虚血瘀证住院患者,其中男7例,女8例,年龄69±14岁,均符合ACC AHA ACP-ASIM联合议定的“慢性稳定型心绞痛诊疗指南(1999年)”以及中华医学会心血管病学分会2000年制订的“不稳定型心绞痛诊断和治疗建议”标准。气虚血瘀证的诊断采用2002年国家食品与药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》制定的标准,痰瘀互阻证为兼有心血瘀阻证和痰阻心脉证者。同时排除以下疾病患者:急性心肌梗死、心肌炎、心脏神经官能症、肋间神经痛;其他疾病引起的心绞痛,如风湿热、梅毒、先天性冠状动脉畸形、肥厚型心肌病、主动脉瓣狭窄或关闭不全者;合并有脑中风、糖尿病、肺部感染、肾炎、肾功能衰竭、泌尿系感染、风湿病、肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病者;妊娠期或哺乳期患者,过敏体质患者。12例健康人年龄、性别相匹配,无血瘀证表现,其余基本情况一致。 1.2 edta抗凝、封装 15例患者于入院2天内取清晨空腹肘静脉血2mL,EDTA抗凝,经4℃、3 000 r min离心10 min。取上清,分装,-80℃保存。健康人也于清晨取空腹肘静脉血,方法同上。 1.3 试剂及试剂 pH4-7固相pH梯度干胶条(IPG)、IPG buffer(pH3-10NL)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、矿物油、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)及考马斯亮蓝R350购自美国GE公司,过硫酸铵(AP)、琼脂糖和甘氨酸购自美国Amresco公司,其它试剂购自北京试剂公司。实验用水为Milli-Q去离子水。 1.4 试验仪器及质谱仪 Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、Ettan DALT six双向垂直电泳仪、Multi TempⅢ温控循环水浴及EPS601电源均为美国GE公司产品。质谱仪为Bruker公司Ultraflex tof tof。分析软件为Imagemaster6.0,GE healthcare。 1.5 高、低丰度蛋白的分离 将各样品加入3倍量的Buffer A,15000 g离心10 min,取上清进样,根据保留时间、色谱峰分别收集高丰度和低丰度蛋白。色谱条件:流速为0.25mL min,柱温为室温,检测波长250 nm,进样量30μL,得到了较高的重复性(图1)。 1.6 蛋白质上样和上样 将各组样品分别混合,参照Amersham公司双向电泳手册和Gorg等的方法进行。采用IPG预制胶条24 cmpH3-10NL。用Bradford法进行蛋白定量,再用水化液调整到合适浓度后上样。蛋白质上样量1.3 mg,梯度升压,等电聚焦总伏小时为100 kVh平衡后胶条转移至13.5%十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS)上进行第2向电泳。16℃恒温,采用恒功率电泳,开始时2.5 W、1 h,再用15W至溴酚蓝到达凝胶的底部边缘。1.7凝胶染色 电泳结束后,凝胶固定过夜,R350 90℃染色10min,脱色至背景透明。 1.8 凝胶的点检测及匹配 凝胶通过UMAX 2100XL扫描,胶图数据存储后,采用Imagemaster 2D Platinum 6.0软件进行凝胶的蛋白点检测及匹配,配合三维图像、Histogram及人工校对等方法,以保证点检测及匹配的准确性。 1.9 质差异点抽提法获得肽质量指纹图 切割蛋白质点置于Eppendorf管中,进行胶内蛋白质酶解后,将从蛋白质差异点抽提所得的肽段通过质谱仪进行分析,获取蛋白样品的肽质量指纹图(由北京华大蛋白质组研发中心完成),最后应用Mascot软件在人类蛋白质公共数据库(NCBI、SWISS-PROT)中搜寻,获得蛋白质的相关信息。 2 结果 2.1 图像分析和差异点分析 经Imag