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1．实验目的：
（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；
（2 ）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术；
2 ．实验材料及用品
（1）实验仪器（apparatus ）：
恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table ）、
高速离心机（High speed centrifuge ）、漩涡振荡器（Vortexmixer ）、超净工作台（Bechtop）、
高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒 （graduated cylind
er ）、 玻璃棒（stir bar ）、 微波炉（microwave ）、 天平（Pan balance）、电泳梳子（ comb ）、
电泳槽 （electrophoresis tank ）、 电泳器 （Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet
transilluminator ）
3 ）、材料与试剂（Reagents）：
①溶液I （Solution Ⅰ）：
50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris ）Tris-HCl （pH8.0 ）；10mmol/L 乙
二胺四乙酸（EDTA） pH8.0
溶液I 可成批配制，每瓶约100ml，10 磅高压蒸气灭菌15 分钟，贮存于4 ℃。
②溶液Ⅱ （Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合
0.2mol/L NaOH （临用前用 10mol/L 贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀
释配制）注意：SDS 易产生气泡，不要剧烈搅拌。
③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀
60mL 5mol/L KAc ，
11.5mL 冰醋酸，
28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）
④TE 液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl （pH8.0 ）；1 mmol/L EDTA （pH8.0 ）
⑤70% 乙醇；
⑥平衡酚：氯仿 1：1：
将量取25 ml Tris-HCl （pH8.0 ）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，
移入棕色玻璃瓶中，4 ℃保存。
⑦LB 培养基：
胰化蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 15g
pH 7.0
⑧琼脂糖（Agarose）；
⑨1 liter （升）5 ×TBE 备用溶液（stock solution）：
54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid ），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0 ；
⑩6 ×凝胶加样缓冲液：
0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue ），40% 蔗糖（sucrose in water ）；
另外还有的试剂是：胰RNA 酶、DNA Marker、硼酸、Gelview 试剂
（2 ）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。
3 ．实验原理：
1）质粒DNA 的提取：
（1）关于质粒：
质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环 的
DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要
性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb 至200kb 以上不等，且拥有自己的复制起始位点，
可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较
大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。
（2 ）一般分离质粒DNA 的方法都包括3 个步骤：
①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；
②收集和裂解细菌；
③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS 法、羟基磷灰石
层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点
以及质粒DNA 的用途进行选择。
（3 ）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA 的原理：
碱裂解法提取质粒DNA
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