高效液相色谱-质谱联用技术快速筛选和确证血液、尿液中精神药品及其代谢物.docxVIP

高效液相色谱-质谱联用技术快速筛选和确证血液、尿液中精神药品及其代谢物 精神药物在临床实践中非常广泛，如抗焦虑、镇静催眠、抗精神障碍等。每年因临床不合理用药、误服误用导致的精神药品中毒事件时有发生。在许多自杀或者抢劫的案件中也经常涉及精神药品的使用或滥用,因此建立准确、快速的体内精神药品筛选及确证分析方法对于司法鉴定和临床诊断治疗都有着非常重要的意义。精神药品通常在很小的剂量就能发挥药效,体内质量浓度很低,有些只达到ng/m L级,因此检测生物样品中的精神药品及其代谢物对于检测方法的灵敏度和准确度都有较高要求。已报道的体内精神药品的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)。GC-MS法受到待测物挥发性、极性、热稳定性的限制,基于三重四极杆质谱仪的LC-MS/MS法通常针对已知目标物的分析,在没有标准品和无法在短时间内优化方法的情况下,难以快速完成检测。近年来发展起来的线性离子阱静电场轨道阱组合式高分辨质谱检测系统(LTQ Orbitrap MS)兼具离子阱和高分辨质谱平行检测的能力。离子阱的多级质谱能够获得结构碎片,高分辨质谱可得到精确相对分子质量,同时配合全自动筛选应用软件Tox ID对高信息量、大量数据文件的高通量数据分析,使化合物的筛查和确证简便化。本研究拟采用高效液相色谱和LTQ Orbitrap高分辨质谱仪建立快速、灵敏的血液及尿液中精神药品及其代谢物的筛选及确证分析方法。建立基于化合物精确相对分子质量的筛选化合物数据库,并将该数据库应用于实际案例中。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 氟硝西养殖氟硝西养殖 56种对照品(地西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、三唑仑、硝基西泮、甲喹酮、氟硝西泮、奥沙西泮、氟西泮、7-氨基硝西泮、替马西泮、咪哒唑仑、唑吡坦、劳拉西泮、α-羟基咪达唑仑、α-羟基三唑仑、氯氮菒卓、N-去甲基氟硝西泮、4-羟基去甲西泮、氯甲西泮、溴西泮、7-氨基氟硝西泮、α-羟基阿普唑仑、普拉西泮、甲丙氨酯、佐匹克隆、氯丙嗪、氯氮平、奋乃静、利培酮、异丙嗪、阿米替林、丙咪嗪、地昔帕明、N-去甲基三甲基丙咪嗪、三甲基丙咪嗪、去甲氟西汀、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、氯米帕明、N-去甲基氯米帕明、曲唑酮、马普替林、普罗替林、西酞普兰、度洛西酊、米氮平、文拉法辛、齐拉西酮、度硫平、去甲基多赛平、氯巴占、去甲替林、喹硫平)均购自美国Cerilliant公司。 甲醇和乙腈(HPLC级)均购自美国Fisher Scientific公司,甲酸和乙酸铵(HPLC级)均购自瑞士Fluka公司;去离子水由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制得。 1.1.2 溶液制备 对照品溶液:将上述56种对照品用甲醇配制成10μg/m L的混合液,备用。 1.1.3 空白血液和体液 由10名近期未服用任何精神药品的健康志愿者提供。 1.2 仪器和条件 1.2.1 高分辨质谱仪仪 Surveyor HPLC液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司),LTQ Orbitrap XLTM组合式高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司),SiroccoTM96孔蛋白沉淀板及蛋白沉淀装置(美国Waters公司)。 1.2.2 柱及柱洗脱程序 色谱柱:Thermo公司Hypersil GOLD PFP柱(50 mm×2.1 mm,3μm)。流动相:A为乙腈,B为含0.1%甲酸和10 mmol乙酸铵的缓冲溶液,梯度洗脱程序见表1;流速:300μL/min;进样量:10μL。 1.2.3 扫描分子质量 电喷雾离子源正离子检测模式(ESI+),喷雾电压4.5 k V,毛细管温度275℃,鞘气30 arb,辅助气10 arb,HCD碰撞池碰撞能量60 V;精确相对分子质量采用外质量校准法(1×10-6),校正液含咖啡因(Mr=194),MRFA(短肽,Mr=523),Ultramark(聚合物,Mr=1 022~1 922);一级扫描分辨率为60 000,二级扫描分辨率为7 500;扫描范围为m/z 100~650。数据采集系统为Xcalibur v2.0.7,高分辨数据筛查软件为Tox ID 2.1.2。 1.3 血液/培养液蛋白 蛋白沉淀板中加入600μL沉淀剂[V(乙腈)∶V(甲醇)=5∶1],随后加入200μL血液或尿液样品。将蛋白沉淀板密封后振荡2 min,然后将板置于蛋白沉淀装置上,用空气泵抽真空2 min,收集滤液。将收集的滤液于氮吹仪40℃空气流下吹干,残留物用缓冲溶液200μL复溶,进样分析。 1.4 有对照品的化合物测定 数据库收录精神药品及其代谢物共61种化合物的分子式及其理论相