DNA序列分析课件.pptxVIP

DNA序列分析;一 Sanger双脱氧链终止法 (chain-terminator method); （一）Sanger双脱氧链终止法原理;（二）双脱氧终止法测序反应体系包括：;Sanger法DNA测序的试剂;（三）测序反应的种类;This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.;This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 to 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGT ;（四）测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳 ACGT次序 高压电泳 4.放射自显影得到直读图象;二 DNA片段序列测定的策略;（一）定向测序策略 定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析 。传统的方法是用高分辨 率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列 分析。 ;（二）随机测序战略 随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy)，此策略是将人 类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建 立亚克隆文库，从中随机挑 取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。 ;（三）多路测序战略 多路测序战略(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅 读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。 将 DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆进行测序。 ;（四）大规模DNA测序的趋势－自动化;1、 克隆筛选 从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。 2、模板制备 现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板 。特定用途的DNA分离仪也已??用。 3、 测序反应 由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以 ，DNA 测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。 ;4、自动放射性自显影阅读机 近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷 上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。  5、自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化 。;310型全自动遗传分析仪;分析仪器的新发展：;优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。;本章重点掌握的内容