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低温和内源激素对凤丹种子萌发的影响 凤丹是著名的医学牡丹，其根皮可以用药物治疗，被称为凤丹皮。凤丹也是用牡丹的好品种。从种子中提取的牡丹籽油的营养成分高于橄榄树。此外，凤丹还可以作为观牡丹育种的砧木。凤丹种子上胚轴具有深休眠特性, 在大田生产中, 9月份播种后只生根、上胚轴不萌发, 需经冬季自然低温打破其上胚轴休眠, 到次年3月份才发芽, 这一特性严重制约了凤丹种苗的商品化生产。 相关研究结果表明:凤丹种子成熟后必须先在暖温条件下沙藏, 在根长达4 cm时进行处理才能有效打破上胚轴休眠;其中, 低温处理20 d以上及300 mg·L-1GA3浸泡24 h解除上胚轴休眠的效果较好。经低温和GA3处理后凤丹种子上胚轴的萌发进程差异很大;GA3处理后种子出苗快, 地上部叶柄伸长速度快, 但幼苗较纤细;而经低温处理后种子出苗慢, 但幼苗较健壮。由于未对低温和GA3处理后种子成苗过程中上胚轴形态变化及物质代谢差异进行同步观察, 因而, 它们对凤丹种子的作用机制尚不清楚。 为此, 作者采用GA3及低温同步处理法, 通过比较凤丹种子子叶、上胚轴、叶原基的形态差异及种胚中碳氮代谢物及内源激素的含量变化, 揭示低温和GA3对凤丹种子上胚轴萌发的作用机制, 以期为凤丹种子休眠解除技术的研究提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 种子处理和渗透 凤丹当年成熟种子于2012年8月中旬采自安徽铜陵凤凰山凤丹种植基地。将种子洗净, 取下沉的饱满种子, 用质量体积分数5%高锰酸钾溶液浸泡消毒2 h, 然后混于湿沙中, 置于昼温25℃、夜温15℃培养箱中贮藏, 昼温和夜温分别处理12 h。 于2012年8月25日至9月28日对凤丹种子进行沙藏层积处理, 待主根长大于4 cm时进行处理。随机取50~60粒种子, 分为3组 (视为3次重复) , 于4℃冰箱中用湿沙层积27 d (视为低温处理) ;为使处理时间同步, 在低温处理第26天取相同数量的层积后种子, 用300 mg·L-1GA3溶液浸泡24 h后将种子置于4℃冰箱保存、备用;将同样数量层积后种子置于培养箱 (室温) 中沙藏, 不进行任何处理, 即为对照。 GA3处理后第11天种子上胚轴已萌发, 故该处理组的种子在浸泡后第3、第8和第11天取样观察;以此为标准, 低温处理和对照组的种子也同步在第3、第8、第11和第27天取样观察。每次取3~5粒种子, 用Leica-S6D体式显微镜观测子叶形态。剩余种子放入-80℃冰箱中保存, 用于下列指标测定。 剥去种子外种皮, 从底部剥开胚乳, 取扇形胚供试。淀粉和可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定;可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法190测定;ZR、IAA、ABA和GA含量采用酶联免疫法252测定;用丙酮提取法提制蛋白质干粉, 然后采用SDS凝胶电泳法183分析蛋白质组分。 分别于对照处理后6个月、低温处理后第27天及GA3处理后第11天观察凤丹种子上胚轴萌发形态, 并分别于对照处理后7个月、低温处理后4个月和GA3处理后2个月观察萌发幼苗的形态。 1.3 处理数据 采用EXCEL 2007和SPSS 20.0统计分析软件进行数据处理、方差分析和LSD多重检验。 2 结果和分析 2.1 上胚轴萌发的影响 不同处理对凤丹种子子叶生长和上胚轴萌发的影响分别见图1和图2。 2.1.1对子叶生长的影响由图1可见, 随着处理时间的延长, 各处理组凤丹种子子叶均不断生长发育, 在胚乳中所占的体积也逐渐增大, 说明子叶的生长发育消耗了胚乳内的营养物质。其中, GA3处理组的种子利用胚乳效率较高, 子叶生长较快, 但子叶形态较细长、扁平。 处理后第8天, 各处理组种子子叶均有所生长, 低温处理组的子叶变大变圆厚, 上胚轴长大、增厚;GA3处理组的子叶生长最快, 上胚轴变细长。在GA3处理后第11天 (上胚轴萌发时) , 子叶几乎充满胚乳, 形态细长扁平, 扭曲上翘, 子叶基部明显膨大、开裂, 上胚轴迅速伸长, 顶端初现叶子雏形和粉红色斑点, 此时即为上胚轴萌发状态, 说明上胚轴萌发需要胚乳和子叶提供营养物质, 促进其萌发。低温处理组种子的子叶生长较GA3处理组慢, 但是子叶形态较圆厚, 在处理后第27天 (上胚轴萌发时) 子叶才几乎充满整个胚乳, 形态扭曲弯转, 此时子叶下端膨大、上胚轴逐渐圆厚, 初现叶子雏形且顶端有粉红色斑点, 表明上胚轴初步萌发。同步条件下, 对照组子叶生长最慢, 未有明显的形态变化。 2.1.2对上胚轴萌发的影响由图2可见:随上胚轴萌发, 其顶部的叶原基随之发育。在GA3处理后第11天, 上胚轴顶端已初见叶子的雏形并呈粉红色, 肉眼可见上胚轴已突破种脐, 且形态细长, 此时, 低温处理组和对照组种子的上胚轴还未有明显的萌动迹象, 但低温处理组的种子基部的上胚轴已