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栀子壳酸性多糖提取条件的优选 人们早就使用红松皮水处理胃癌。现代研究也证实了这种糖原的强烈肿瘤、抗菌和抗癌作用。抑制神经损伤后，能显著抑制sd80实体瘤的传播，降低小鼠伤寒杆菌感染小鼠的死亡率。在外部培养的羊膜细胞（fl）的营养成分中添加沙子壳中的酸性糖后，可以保护fl细胞对3型（adv3）、7型（adv7）、水泡性口炎（vsv）和柯萨奇病毒b4（cb4）的感染，尤其是对vsv和cb4感染的保护作用更好。并且,该多糖在体外对HIV(HTLV-Ⅲ)感染MT-4Cells具有病理抑制作用,对猫免疫缺陷病毒(FIV)感染也具有一定的保护作用。同时,该多糖细胞毒性极低,原料来源广泛,具有很好的生物活性和临床应用前景。但有关该类多糖提取条件研究尚未见报道,本文以提取物中多糖含量为指标用苯酚-硫酸法检测,研究了多糖提取过程中浸提时间、温度、固液比、浸提次数等因素对多糖含量的影响,确定了红松松子壳酸性多糖的最佳提取条件。 1 材料和方法 1.1 原材料 长白山产红松松子壳(已粉碎)。 1.2 u3000温鼓风干燥箱、ld5-2m与kb-循环水式无水乙醇、乙酸、苯酚的含量 电热恒温水浴锅,725-P紫外可见分光光度计,FA/JA电子天平,DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、LD5-2A低速离心机,SKB-Ⅲ循环水式多用真空泵;无水乙醇、乙醚、浓硫酸、苯酚均为国产分析纯。 5%苯酚溶液的制备:称取苯酚100 g,铝粉0.1 g,碳酸氢钠0.05 g混匀沙浴加热,收集180～182℃馏分,称取10 g,加水190 g,置棕色瓶中冷藏遮光备用。 1.3 混合溶剂浸泡液混合溶剂 原料经简单水洗,70℃烘干,用乙醇∶乙醚(1∶1)混合溶剂浸泡过夜,60℃水浴回流2 h,烘干备用。采用热水浸提法,提取松子壳酸性多糖,研究浸提时间、温度、固液比和提取次数等单因素对多糖含量的影响。 1.3.1 提取时间对多糖含量的影响 在选定固液比为1∶3,浸提温度为80℃不变的条件,浸提1次,比较不同浸提时间(1,2,3,4,5,6 h)对提取物中多糖含量的影响,以选择最佳提取时间。 1.3.2 提取温度和选择实验 固液比为1∶3,提取时间由上一实验确定,分别在70,80,90,100℃的条件下浸提1次,测定多糖含量,确定最佳提取温度。 1.3.3 固液体比m，v的选择 在前面实验确定的提取时间和温度下选择固液比为1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6各浸提1次,测定多糖含量,确定最佳固液比。 1.3.4 提取物选择试验 在提取时间、温度和固液比均确定条件下,分别浸提1,2,3 次,比较多糖含量,选择最佳提取次数。 1.4 活力棕榈酸乙酸酯的正交实验 根据单因素实验确定的条件范围,通过L9( 34) 正交实验得出最佳提取条件。 1.5 多酚测定 1.5.1 标准曲线的制备 标准葡萄糖溶液的制备:精确称取105℃,干燥恒重的葡萄糖5.0 mg溶解在100 ml容量瓶中制成浓度为50 μg/ml的标准葡萄糖溶液。分别吸取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,1.2,1.4 ml标准葡萄糖溶液放入10 ml具塞试管中,用蒸馏水补足至2 ml,分别加入1 ml 5%苯酚溶液,7 ml浓硫酸,充分混匀后,迅速浸入沸水浴中加热15 min,取出冷却至室温,在490 nm处,测其吸光度值,以光密度(A)为纵坐标,多糖浓度(C)为横坐标,得标准曲线,算出回归方程。由测定结果算出回归方程为: C(μg/ml) = 81.267A- 4.957,r= 0.998 1.5.2 样品多糖含量的计算 取经干燥恒重的松子壳提取物2.5 mg溶于50 ml容量瓶中,吸取样品液2 ml放入10 ml具塞试管中,余下同标准曲线操作,将所测光密度值代入回归方程,即可算出样品中多糖的含量,计算公式如下: 提取物中多糖含量(%)=(样品中多糖浓度×稀释倍数/称量样品干重)×100% 1.6 稳定实验 取4份多糖样品在3 h内,每30 min测1次光密度值。 1.7 标准曲线回收率的测定 采用标准加样回收法,既吸取多糖样品溶液1 ml,分别加入标准葡萄糖溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1 ml放入10 ml具塞试管中,余下同标准曲线操作,分别测其光密度值,根据葡萄糖的检出量,计算其回收率。 2 结果与分析 2.1 单因素的试验结果和分析 2.1.1 提取物时间实验的结果和分析 不同浸提时间对松子壳提取物中多糖含量的影响见表1,由数据分析,选择浸提2 h为宜。 2.1.2 试验结果与提取物温度分析 见表2。由数据分析可知,选择浸提温度为80℃。 2.1.3 提取物提取物的结果与分析 见表3。由数据分析可知,选择浸提固液比为1∶3。 2.1.4 提取物的结果与分析 见表4。由数据分析可知,选择浸提次数为3