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双水相萃取技术在生化分离中的应用 萃取液是一种广泛用于测定工艺的分离提取方法。随着生物技术 (如基因工程、蛋白质工程、代谢工程、细胞培养工程等) 的高速发展, 常规的萃取技术在这些领域中的应用受到限制, 因为大部分的生物制品原液是具有低浓度和生物活性的, 对分离条件以及环境有着严格的要求。双水相萃取 (Aqueous two-phase extraction, ATPE) 技术正是由于适应这种特殊的分离要求而被广泛应用于生物化工行业。双水相萃取技术始于20世纪60年代, 1979年德国GDF和Kula等人将双水相萃取应用于生物产品的分离, 由于其条件温和, 容易放大, 可连续性操作, 已经成功地应用于氨基酸、蛋白质和核酸的分离和提纯。国内自20世纪80年代开始对双水相萃取技术进行研究, 经过20多年的发展, 已经在生物制药、分析检测、稀有金属的分析分离等领域有研究和应用。 目前国内外对双水相萃取技术的研究主要集中在: (1) 双水相体系成相机理及热力学模型的探索。由于双水相体系自身的复杂性, 目前还没有一套完整的理论来解释双水相体系, 近年来对双水相液-液相平衡的热力学模型的研究非常活跃; (2) 新型、高效、廉价的双水相体系的开发。如用低分子有机物与无机盐所形成的双水相体系来分离提取中草药。这种双水相体系的引入, 可以大大节约能耗, 降低成本, 简化操作流程, 提高产品收率, 为大规模工业化的实现提供了可能; (3) 双水相萃取技术应用领域的拓展, 利用其它相关技术对双水相萃取过程优化。如双水相技术与相关技术的集成问题, 就充分地利用了双水相体系的技术和条件优势, 为分离科学提供了新思维; (4) 双水相萃取技术中体系的放大以及新工艺流程的开发等。 1 双水相萃取技术的基本原则 1.1 双水相的成相原理 当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液, 或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时, 能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系, 这就是双水相体系。从溶液理论来说, 当2种有机物或者有机物与无机盐混合时, 是分相还是混合成一相, 取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力。由于双水相体系本身的复杂性, 体系的熵很难准确计算, 分子间的相互作用力也不清楚, 所以双水相的形成机理很复杂。 对于高聚物/高聚物双水相体系, 用传统的理论来解释, 是由于界面张力等因素形成两相之间的不对称, 使得在空间上产生阻隔效应, 使两相之间无法相互渗透, 不能形成均一相, 从而具有分离倾向, 一般这种分离倾向的大小和形成双水相的2种物质的疏水性成线性关系。对于有无机盐存在的双水相体系, 以及新开发的表面活性剂双水相体系, 这种解释就无能为力了。表1是各种双水相体系的成相原理。 由表1可知, 不同的成相原理可以解释不同组成的双水相体系, 但各种原理并不能普遍适用, 而且各种原理间的相互关系也十分复杂。因此双水相体系的成相原理以及溶液理论有待进一步深入研究。 1.2 分离系统的运作 双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似, 都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的浓度不同, 从而达到分离的目的。溶质 (包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst分配定律: K=Ct/Cb 其中ct、cb分别代表溶质在上相、下相中的浓度。 系统固定时, 分配系数为一常数, 与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后, 在上相和下相间进行选择性分配, 这种分配关系与常规的萃取分配关系相比, 表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0.01, 因此为物质分离提供了可能。 1.3 双水相体系间的分配系数 影响物质在双水相体系中分配的因素有很多, 其中主要包括体系有机相组成 (如有机物的类型、平均分子量等) 、盐类 (包括离子类型和浓度、电荷数、电解质强度、酸碱性等) 、相比R(上下相的体积比) 、溶质即目标物质的物理化学性质 (包括分子量, 等电点) , 以及体系的温度、压力等。而这些参数并不是独立起作用的, 所以要预测双水相体系间的分配系数是相当困难的。目前最常用的方法是用试验的方法来确定满足分配要求的操作条件。 1.4 曲线acb、系线ab、相区、东南角 双水相系统的相平衡可以用类似于传统的溶剂萃取的常规方式描述。图1表示了30 ℃异丙醇-硫酸铵-水系统的相图, 它由一条双节线 (曲线ACB) 、系线AB、临界点C组成。双节线上方为两相区, 下方为单相区。对于某些由聚合物组成的双水相体系其上下相密度与水密度接