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不同组合的冷冻保护剂对小鼠卵巢组织的影响 随着医学水平的快速发展，肿瘤患者的长期生存率显著提高，但大剂量放射化疗对患者的内经功能和生育能力产生了严重影响。卵巢组织冷冻保存是一种较理想的卵巢功能保存方法。目前常用的冷冻方法是程序化冷冻, 但它需要昂贵仪器, 费时, 消耗液氮多。而玻璃化冷冻是一种简单、高效、快速的冷冻方法。在超低温条件下, 高浓度的玻璃化冷冻液渗入到细胞内部, 使之处于玻璃化状态而不形成冰晶, 因此对细胞的损伤较小。1985年Rall等首先使用玻璃化冷冻法进行鼠类胚胎的冷冻, 此后在较多方面得到应用, 包括动物及人类胚胎、卵子、人类干细胞和卵巢皮质组织等。但目前尚无公认的、统一的标准最佳玻璃化溶液配方。卵巢组织结构不同于胚胎和囊胚, 有特定的空间立体结构, 多种类型细胞, 细胞密度高, 有一套血管系统, 因此适合卵巢组织玻璃化冷冻的冷冻保护剂配方需进一步探讨。 本研究利用不同组合的冷冻保护剂, 观察比较玻璃化冻融小鼠卵巢组织的形态学改变, 探索出适合冷冻卵巢组织的理想的玻璃化冷冻保护剂组合, 为玻璃化冷冻保存人类卵巢组织的研究奠定基础。 材料和方法 一、 材料表面 1. 实验动物 选取清洁级的昆明小鼠20只, 2w龄, 体重为10g。由上海交大医学院动物房提供, 饲养条件符合国家实验动物的饲料标准。 2. 胎牛和血清试剂 乙二醇 (EG) 、二甲基亚砜 (DMSO) 、改良磷酸缓冲液 (DPBS) 、丙二醇 (PROH) 和蔗糖购自美国Sigma公司。胎牛血清购自杭州四季清公司。塑料麦管购自法国IMV公司。 二、 实验方法 1. 玻璃冷冻 (1) 皮肤组织病理学观察 将20只昆明小鼠随机分为4组, 每组5只, 用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠 (50mg/kg) , 常规消毒后, 分别在两侧肋脊角处剪开皮肤及肌肉, 暴露卵巢, 在解剖显微镜下剪开卵巢囊, 完整剪下双侧卵巢。用DPBS液清洗卵巢3次, 然后剪成 (1mm×1mm×1mm) 的组织块, 用于冷冻保存。 (2) 复配液 冷冻液和解冻液均采用含10%胎牛血清的DPBS作为基础液。冷冻保护液分为3组:A组20%EG (v/v) +20%DMSO (v/v) +0.5mol/L蔗糖。B组20%EG (v/v) +20%PROH (v/v) +0.5mol/L蔗糖。C组 20%PROH (v/v) +10%DMSO (v/v) +0.5mol/蔗糖。冷冻预平衡液为渗透性冷冻保护剂浓度的1/2+DPBS (含10%胎牛血清) 。解冻液a、b、c分别为0.5、0.25、0.125mol/L蔗糖+基础液。 (3) 麦管和麦管的渗透 先将卵巢组织块移入预平衡液中, 4℃渗透平衡15min, 再移入冷冻液, 继续渗透平衡, 5min内装入麦管, 每根麦管有2个卵巢组织, 然后直接投入液氮中保存。 (4) 组织块的处理 冷存一周后, 从液氮罐中取出麦管, 置空气中停留30秒, 迅速放入30℃水浴锅中解冻, 冷冻液融化后, 将卵巢组织块依此移入解冻液a、b、c中, 每次置室温10min, 然后用基础液漂洗卵巢2次, 每次5min, 最后将组织块放入盛有TCM 199培养液 (美国Sigma公司) 的培养皿中, 在37℃二氧化碳培养箱培养6h后固定。 2. 形态正常与卵母细胞形态表现 将部分新鲜和复苏的卵巢组织制成切片, HE染色, 光镜下观察卵泡、卵母细胞和颗粒细胞的形态和结构。形态正常的卵泡表现为卵泡与卵母细胞呈圆形, 颗粒细胞分布均匀, 基底膜完整。如果卵泡与卵母细胞形态不规则;卵母细胞与卵泡细胞之间出现空隙, 或与基膜分离;卵母细胞出现核浓缩;颗粒细胞形态异常, 分布不均匀, 为异常卵泡。每组随机选择5张切片, 分别计数正常卵泡和异常卵泡, 图1见封三。 3. tdt转换染色 将各组卵巢组织石蜡切片用TUNEL方法染色, 观察卵泡内卵母细胞和颗粒细胞凋亡情况。切片常规脱蜡和水化, 以蛋白酶K消化后, 用0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性, 然后加荧光素标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶 (TdT) 混合液, 37 ℃孵育60min。加POD转换剂后, DAB室温避光显色, 苏木精复染后封片。TdT缓冲液代替TdT酶作为阴性对照。卵母细胞核内出现棕黄色颗粒视为卵母细胞凋亡的卵泡;≥2个颗粒细胞核内出现棕黄色颗粒为颗粒细胞凋亡的卵泡。 4. 免疫总苏-四氧化学体3.2 测定Bcl-2 和Bax蛋白 (一抗稀释1∶200) 表达免疫组化试剂盒 (S-P法) 由武汉博士德公司制造。将卵巢切片 (4μm) 贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上, 60℃烘烤4h。切片常规脱蜡和水化, 然后放入枸橼酸钠修复液中, 置微波炉抗原修复10min, 冷却, PBC洗5min×3。随后按