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茎尖微嫁接技术在无病木培养中的应用 佛手柑科。var.sacodiciii已经是广州科的一种柑橘植物。这种干燥的水果通常是具有益肝、理气、胃痛的常用中药。佛手在我国栽培历史悠久,为广东道地药材“十大广药”之一。佛手在生产中面临黄龙病的危害,黄龙病是由类细菌Liberobacter asiaticum引起的毁灭性和传染性病害,主要通过木虱转移吸食和带病苗木、接穗等繁殖材料传播。发病初期,新抽出的枝梢,其叶片不能正常转绿,表现斑驳或均匀黄化症状,直至全株枯黄死亡,且迅速蔓延,目前对病害本身还无有效的防治手段。而且,佛手生产上采用扦插和嫁接繁殖,长期的无性繁殖,病原体逐代传递和积累,造成植株长势减弱、生活力下降、产量降低、品质下降,严重威胁佛手的生产和药材质量。佛手产区的扩大,使得接穗和苗木在不同地区间传送,又加剧了病害的扩散和蔓延。因此,运用现代生物技术培育脱病原体苗,已成为佛手生产中极为迫切的问题。茎尖微嫁接技术可以脱除病原体,已在柑桔、沙田柚上获得成功,并逐步在生产上应用。本文采用茎尖微嫁接技术脱除佛手病原体,并应用聚合酶链式反应(PCR)对其进行黄龙病病原检测,以建立行之有效的病原检测方法,从而为佛手品种复壮和种质资源的可持续利用奠定基础。 1 材料、机器和试剂 1.1 黄自生苗,生苗 感染黄龙病的佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle,来源于广东省肇庆地区,通过电镜和PCR检测证明感染了黄龙病病原;砧木为柠檬Citrus limon(Linn.) Burm.f.C.medica.var.limon Linn.实生苗;感染黄龙病的甜橙(采自广州市罗岗镇);健康一年生柠檬实生苗(采自广州中医药大学药圃)。以上材料的原植物均由广州中医药大学中药鉴定学教研室张丹雁教授鉴定。 1.2 pcr检测方法 PCR仪(Applied Biosystems 2720 Thermalcycler);UVP GDS7600型凝胶成像仪;TECAN Spectra FLUOR plus多功能酶标仪;SK2492型PCR扩增试剂盒及引物(加拿大Sangon独资上海分公司);3 s柱离心式植物基因组DNA试剂盒;DNA Marker(200bp DNA Ladder plus)。 2 方法 2.1 茎尖微移植 2.1.1 养基、养基、培养条件 取成熟柠檬果实中的种子,经表面消毒,剥去种皮,接种于MS培养基上,在培养箱中黑暗条件下培养,培养温度为28℃;采摘2～3 cm长的佛手病株嫩芽,切取0.5～1 cm茎尖,经常规消毒后,在双目显微镜下剥取约0.2 mm的茎尖作为接穗。 2.1.2 插装法提取“t”字 在无菌条件下,将砧木苗从培养瓶中移出,切去部分过长的根并去顶,在双目显微镜下,用自制的解剖刀在上胚轴上切成倒“T”字形切口,将茎尖接到砧木的倒“T”字形切口上,外缠parafilm膜。 2.1.3 附加6-ba 将嫁接苗移入带滤纸桥的液体培养基中,以MS为基本培养基,附加6-BA 0.1mg·L-1和7.5%的蔗糖;培养温度为25±1℃,每d光照12 h,光照强度为2 kLx。观察嫁接苗的长势,45 d后记录嫁接成活率。 2.1.4 采用SPSS 11.5统计软件对计量资料进行方差分析,比较采用LSD法。 2.2 龙庆病抗病性 2.2.1 pcr检测dna分离效果 采用3 s柱离心式植物基因组DNA试剂盒分别提取各样品总DNA。将提取到的DNA用纯水稀释10倍后,用酶标仪分别测定其在260 nm、280 nm处的吸收值,计算出OD260与OD280的比值及DNA浓度,并以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果的优劣。 2.2.2 pcr检测结果 采用3 s柱离心式植物基因组DNA试剂盒提取样品总DNA,紫外分光度法检测DNA纯度和浓度,并以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果。根据法国Villechanoux教授发表的黄龙病部分DNA序列(基因序号码为M94319)设计引物。引物P1(TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGAG)与黄龙病DNA序列的37～60位核苷酸同源;引物P2(ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG)与462～485位核苷酸互补,PCR产物的分子量为570bp。 2.2.3 pcr检测taq酶2.55 反应体系为1 O×buffer缓冲液5μL,dNTPs 5μL (2 mmol/L),MgCl23μL(25 mmol/L),Taq酶0.5μL (5 u/μL),引物各0.5μL(30μmol/L),DNA模板100 ng,加入灭菌纯水至50μL。循环参数为94℃5 min,随后94℃1min,55℃1 min,72℃1.5 min,35个循环,最后72℃延伸10 min。