免疫荧光细胞化学技术.pptVIP

第四章 免疫荧光细胞化学技术;免疫荧光细胞化学技术 (immunofluorescence cytochemistry) 采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针，检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本，根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的性质并定位，以及利用定量技术测定含量。;荧光抗体法： 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。 较常用 荧光抗原法： 用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。 荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术;免疫荧光细胞化学方法： 直接法、间接法 免疫荧光染色标本制备： 涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片…… 经适当固定后染色，或不固定直接染色。 ;主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法 八、免疫荧光细胞化学的对照染色;一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。;荧光 (fluorescence) 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。;二 荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素； 必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。 ;(1)异硫氰酸荧光素(FITC) 呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子 ;(2)四乙基罗达明(RB200) 褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。 ;(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC) 紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。 最大吸收光谱:550nm 最大发射光谱:620nm (4) 4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光 (5) 得克萨斯红（Texas red） (6) 藻红素R (7) 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）…;四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1 特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色 2 非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色 3 吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原 标本染色，结果无明显阳性荧光。 4 F/P比值的测定方法 F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量， F/P=1-2， 过高------非特异染色增强； 过低------荧光很弱，降低敏感性。;荧光抗体的保存;五、荧光抗体染色方法 适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定； 方法：直接法、间接法; 阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。 ; 2 间接法 （1）基本原理　先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光