流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项.docxVIP

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项 (一) 原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克 隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根 据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二) 操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用 10％FCS RPMI1640 调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml μ l) ↓ 取 40μ l 细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50 的小玻璃管或塑料离心管，再加 50μ l 1∶20(用 DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入50μ l 工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓ 4℃ 30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液 2ml 左右1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为 FCM 制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl 固定液) ↓ FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7 天) (三) 试剂和器材 各种特异性单克隆抗体。 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 (四) 注意事项 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的 NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结 合，出现假阴性。 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc 受体， 降低和防止非特异性染色。 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: DPBS (×10, 贮存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸 馏 水 加 至 1000ml Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10 稀释KH２PO４ 2g 洗涤液 DPBS 900ml FCS 50ml (终浓度 5％) 4％NaNO３ 50ml (终浓度 0.2％) 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g (终浓度 2％) 甲 醛 10ml NaNO３ 0.2g (终浓度 0.02％) 流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约 1X106 细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl 的HAB，并充分混匀，于室温中静置1 分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育 20-60 分钟后，用 PBS(pH7．2 —7．4)洗 1-2 次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便， 结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标 抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约 1X106 细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM 检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光 背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。 另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非 特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血 清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构 的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与 5%至 10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。 此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期