第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞 有限稀释法 第二十九页，共八十二页，2022年，8月28日 效率最高 价格昂贵 FACS 第三十页，共八十二页，2022年，8月28日 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮? “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏 第三十一页，共八十二页，2022年，8月28日 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义 第三十二页，共八十二页，2022年，8月28日 第二节 单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 第三十三页，共八十二页，2022年，8月28日 一、单克隆抗体的产生 动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只 体外培养法： 中空纤维培养系统? 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 第三十四页，共八十二页，2022年，8月28日 腹腔注射法 第三十五页，共八十二页，2022年，8月28日 前5天进行,预先腹腔注射pristane （1～5）×106细胞 1～3w形成腹水 高滴度腹水 第三十六页，共八十二页，2022年，8月28日 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞） 二、 单克隆抗体的纯化 第三十七页，共八十二页，2022年，8月28日 ELISA 第三十八页，共八十二页，2022年，8月28日 ELISA 第三十九页，共八十二页，2022年，8月28日 多头加样枪 第四十页，共八十二页，2022年，8月28日 。 免疫荧光法 第四十一页，共八十二页，2022年，8月28日 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 McAb的纯化 第四十二页，共八十二页，2022年，8月28日 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 三、 单克隆抗体的性质鉴定 第四十三页，共八十二页，2022年，8月28日 四、单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 （一）单克隆抗体的特性 第四十四页，共八十二页，2022年，8月28日 优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 （二）单克隆抗体的优点与局限性 局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高 第四十五页，共八十二页，2022年，8月28日 McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 　　 稳定 　　低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 McAb与PcAb的比较 第四十六页，共八十二页，2022年，8月28日 McAb and PcAb 第四十七页，共八十二页，2022年，8月28日 第三节 基因工程抗体制备 基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。 第四十八页，共八十二页，2022年，8月28日 将小鼠Ig