蛋白质核酸沉淀分离技术.pptVIP

方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃ 4、盐析曲线的制作 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液） 以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 第二十九页，共七十一页，2022年，8月28日 蛋白质量(mg)或酶活力 硫酸铵饱和度％ 蛋白质量(mg)或酶活力 硫酸铵饱和度％ 第三十页，共七十一页，2022年，8月28日 方法二 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度 以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 第三十一页，共七十一页，2022年，8月28日 蛋白质量(mg)或酶活力 硫酸铵饱和度％ 蛋白质量(mg)或酶活力 硫酸铵饱和度％ 第三十二页，共七十一页，2022年，8月28日 5、盐析的影响因素 （1） 离 子 强 度 与 离 子 类 型 S：离子强度为I时蛋白质的溶解度； S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度； KS：盐析常数。 盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系： 当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，S0是一常数β（溶解度常数） 第三十三页，共七十一页，2022年，8月28日 KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。 多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS ； 大而不规则的蛋白分子KS越大。 KS主要取决于盐的性质： 离子价数 离子半径 介电常数 KS 几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾硫酸钠磷酸铵柠檬酸钠硫酸镁 第三十四页，共七十一页，2022年，8月28日 1——纤维蛋白 2——血红蛋白 3——拟球蛋白 4——血清蛋白 5——肌红蛋白 几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图 第三十五页，共七十一页，2022年，8月28日 KS分段盐析法 Β分段盐析法 在一定pH、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。 在一定离子强度下，改变pH、温度。适于后期分离纯化和精制。 第三十六页，共七十一页，2022年，8月28日 （2） 蛋 白 质 浓 度 硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白： 蛋白质浓度g/L 硫酸铵饱和度% 结果 30 58 开始沉淀 3 66 开始沉淀 30 65 90%沉淀析出 当蛋白浓度增加10倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小7%。 适宜蛋白质浓度是2.5％～3.0％（25 mg/mL～30mg/mL） 第三十七页，共七十一页，2022年，8月28日 （3） pH 的 影 响 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。 在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样 注意 第三十八页，共七十一页，2022年，8月28日 （4） 温 度 的 影 响 温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。 但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。 在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。 第三十九页，共七十一页，2022年，8月28日 1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。 6、注意事项 第四十页，共七十一页，2022年，8月28日 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。 二、等电点沉淀法 第四十一页，共七十一页，2022年，8月28日 （1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 第四十二页，共七十一页，2022年，8月28日 未沉淀蛋白质的分率 pH对大豆蛋白质溶解度的影响 第四十三页，共七十一