lncRNANEAT1在乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达及作用机制.docx

? ? lncRNANEAT1在乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达及作用机制 ? ? 司 刚，司 贞，钟国南，钱丽华 (1海口市妇幼保健院药学部，海口 570102；2琼海市中医院药学部；3海南医学院基础医学与生命科学学院) 乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来，随着环境与生活方式的改变，乳腺癌的发病率急剧上升，严重威胁女性生命健康[1-3]。目前临床应用的多数治疗策略仅针对乳腺细胞，而忽视了对肿瘤微环境的改善，但研究表明，肿瘤微环境在乳腺癌的发生发展中起着重要作用[4,5]。肿瘤微环境是肿瘤细胞生存的复杂环境，主要由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和细胞外基质组成[5]。其中巨噬细胞作为肿瘤间质中的重要细胞群，能通过呈现特殊的表型特征参与调控肿瘤的发生与进展[6-8]。有数据表明肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)能促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移和免疫逃逸，并促使肿瘤细胞对多种药物产生耐药性等[7-9]。因此，积极探究调控乳腺癌微环境中TAMs分化及功能的相关机制具有重要意义。 长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其在生物体的生命运动、基因表达、细胞周期和个体发育以及免疫细胞分化等方面发挥重要作用[10,11]。既往研究报道，lncRNA NEAT1在乳腺癌组织与细胞中的表达呈异常升高现象，且与较高的组织学分级和患者不良预后密切相关[12-16]。近年来进一步的研究证实，lncRNA NEAT1可在体内外通过多种途径促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭与迁移[13-16]。而在其他疾病中，lncRNA NEAT1还能通过调控巨噬细胞的分化，从而参与调控疾病的进展[17,18]，但在乳腺癌微环境中高表达lncRNA NEAT1是否同样能够参与调控TAMs的形成与维持尚不清楚。因此，本研究通过体内外实验探究lncRNA NEAT1在乳腺癌中TAMs的作用，以期进一步阐明乳腺癌的发生与发展的相关机制。 1 材料与方法 1.1 临床样本来源 选取自2019年10月至2021年1月海口市妇幼保健院确诊的30例乳腺癌患者的肿瘤组织和30例健康体检患者的外周血作为临床样本。乳腺癌患者的年龄在33～77岁之间，平均年龄为(55.4±9.2)岁。临床病理学分析显示，Ⅰ～Ⅱ期患者21例、Ⅲ期患者9例,淋巴结转移患者10例。对照组年龄在37～79岁之间，平均年龄为(58.6±8.4)岁，两组受试者的年龄差异无统计学意义(P0.05)。 纳入标准：①两组受试者均为女性患者；②乳腺癌患者术后诊断诊断为原发性乳腺癌，且术前均未接受放疗、化疗或免疫抑制剂等相关治疗；③两组受试者均未合并其他组织或脏器的原发性恶性肿瘤、免疫系统及内分泌等相关疾病；④两组受试者的临床资料完整，且患者及家属知情同意。使用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离乳腺癌组织中的TAMs(TAMs组)和健康体检患者外周血中的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(PBMC组)，并使用RT-PCR实验检测巨噬细胞在TAMs组与PBMC组中的极化水平及lncRNA NEAT1的表达。本研究获得我院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。 1.2 主要材料与试剂 乳腺癌细胞系MCF-7购自美国ATCC菌株保藏中心;人单核巨噬细胞THP-1与小鼠巨噬细胞系Raw264.7均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；30只6周龄的雌性BALB/c裸鼠购自海南药物研究所有限责任公司；靶向沉默lncRNA NEAT1基因表达和阴性对照的慢病毒载体(LV-shNEAT1与LV-NC,病毒滴度为4×108TU/ml)由江苏金斯瑞生物科技有限公司构建与合成；MTT试剂，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(美国Thermo公司)；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(0.4 μm与8 μm孔径)(美国Millipore公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(购自美国Gibco公司)；Ficoll淋巴细胞分离液、Ⅳ型胶原酶、DNase Ⅰ酶、佛波酯(PMA)、青霉素(100 U/ml)与链霉素(100 μg/ml)混合溶液、干扰素-γ(interferon γ， IFN-γ),白细胞介素-4(interlukin-1, IL-4)，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(美国Sigma公司)；兔抗小鼠TNF-α,人类