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不同品种葡萄种质资源的ssr指纹图谱研究 葡萄是葡萄科的一种落叶藤本植物。葡萄糖是人类最古老的果树之一，占世界水果产量的14%左右。它具有很高的营养价值，可以加工成葡萄糖、干果和葡萄糖等。葡萄的种类全世界有8 000多种,我国有500种以上,按品种可分为鲜食葡萄品种和酿酒葡萄品种。由于葡萄属植物不同种间及品种间在解剖形态、经济性状和抗逆性方面有着极其丰富的变异,葡萄资源的分类鉴定十分困难。葡萄资源的分类基本上以形态学标记为主,随着生物技术的发展,更需要从DNA水平对物种的亲缘关系进行研究。 SSR(Simple Sequence Repeat)即DNA的简单重复序列,是一种具稳定性、可重复性、强特异性、共显性等诸多优点的分子标记技术,比RFLP标记操作简单和快速,在基因定位、遗传作图、品种鉴定等方面得到了广泛的应用。目前,SSR标记已经在葡萄基因组作图、进化关系、品种鉴定等研究领域展示出巨大的应用潜力。SSR标记可作为联系遗传图谱、序列信息以及最终的表型差异三者之间的重要纽带。该研究选取了45个鲜食葡萄品种,利用位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增研究,从分子水平上探讨45份葡萄种质的亲缘关系,为有效利用DNA标记评价葡萄种质资源亲缘关系提供理论依据。对葡萄育种、种质资源管理及其保护具有重要意义。 1 材料和方法 1.1 dntp、taqcda和20p基因 供试的45个葡萄品种取自郑州果树研究所国家果树种质(郑州)葡萄圃。采集葡萄幼嫩叶片,低温下带回实验室,于超低温冰箱中保存备用。 dNTP、TaqDNA聚合酶、20 bp DNA Marker购自TaKaRa公司。所有PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反应使用Biometer公司的TG型PCR循环仪。 1.2 葡萄基因组dna提取 用改良十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl Trimethy Ammonium Bromide,CTAB)法提取葡萄基因组DNA,反应前用微量紫外进行DNA质量与浓度检测。 1.2.1 pcrpcr 反应液体积为10 μL,其中含:1×PCR buffer,引物0.4 μmol/L,模板DNA 30 ng,dNTP 0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.5 U。 1.2.2 引用参数的选择 分别从葡萄的19对染色体上选择19个SSR位点(表2)。 1.2.3 低温4h短环 94℃预变性4 min;94℃变性1 min、52~55℃退火1 min、72℃延伸1 min,30个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存20 min。 1.2.4 agno3染色 扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,PCR产物加入等体积的6×Loading Buffer,每个加样孔加样量为3 μL,加样后,在230 V电压下电泳90 min。电泳完毕取出进行AgNO3染色:0.1% AgNO3银染10 min;水洗后用显色液(1.5% NaOH,0.4%甲醛)显色,直至条带清晰为止,照相并记录。 1.3 聚类分析方法 有DNA扩增带记为1,无带记为0。利用NTSYSpc 2.10e软件进行Jaccard相似性分析,并通过非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析,建立亲缘关系图。 2 结果与分析 2.14 引物扩增位序 19对引物扩增条带清晰、 重复性好、特异性高。由表3可知, 19对引物在45个葡萄品种中共在76个位点 上扩增出条带,平均每对引物有4个扩增位点,扩增位点数量最多的引物Vchr1a、Vchr3a、Vchr5c、Vchr18a为5个;19对引物共扩增出74个多态性位点,平均每对引物扩增多态性位点3.89个,多态性位点占的比例平均为96.93%;19对引物对45个葡萄品种的区分率为100%。 2.2 葡萄品种间的遗传距离 选择了45个葡萄材料的SSR扩增的90~300 bp范围内条带分别赋值,同一位置有带的记为1,无带的记为0。根据19对引物对45个葡萄品种基因组DNA的扩增结果,通过计算,建立树状聚类图。由图3可知,45个葡萄品种间的遗传距离为0.01266~0.51227,平均遗传距离为0.37836;其中,“选拔巨峰”和“伊豆锦”间遗传距离最小,为0.01266,“尼加拉”和其它品种间遗传距离均较大,平均为0.51465。根据扩增结果将参试的45个品种聚类,在遗传距离0.41处做结合线,可将其划分为三大类:第一类包括“摩尔多瓦”、“罗曼尔”、“着色香”、“秀特玫瑰”品种;第二类为“尼加拉”、“美洲白”、“维金纳斯”、“黑虎香”、“早熟黑虎香”等品种;第三类为“玫瑰后”、“阿特巴格”(紫)、‘Black seedless’品种。 3 ssr标记构建葡萄品种图谱的可行性 研究结果表明,利用SSR的19对基本核心引物标记能够充分