生物化学实验技术PowerPointPresenta.pptxVIP

生物化学实验技术;生物化学实验技术;实验一 ;【目的要求】 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。;【实验器材】 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计;【方法步骤】;各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 ;【注意事项】;【思考题】;实 验二;【目的要求】 ①了解分光光度法的基本原理； ②能较熟练使用紫外分光光度计。;【实验器材】 1．紫外分光光度计。 2．微量加样器。 3．蛋白标准液（1mg/ml）。 ;【方法步骤】;管号 ;混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白质的浓度为横坐标绘制标准曲线。 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混匀，按上述方法测其吸光度。;【结果与分析】;【注意事项】;【思考题】; （一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化;1．?掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2．熟悉盐析和层析的基本操作；3． 掌握离心机的正确使用方法。;【仪器试剂】 试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸铵溶液。; 【实验原理 】;中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。;（2）盐析的影响因素;;3.检测分离效果;1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋白）。 ;; ⑴ 装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。 ;（2）加样：;（3）收集： 加样同时可进行收集，每管收集1ml。收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶和尼龙??等。 ;【实验结果】;1．?使用离心机前注意配平； 2．?装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整； 3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间； 4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下； 5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。;【思考题】 1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？ 2. 盐析与变性的异同？ 3．凝胶层析的原理？;（二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳;1. 掌握电泳的基本原理；2. 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和  应用。 ;【仪器试剂】 电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗掖。; 【实验原理 】;2.本实验分离全血清中各种蛋白质成分，同时鉴定上次实验提纯结果。;1. 准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样，即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全血清。 2. 电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电压110V，通电40-45min； 3．染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。;【实验结果】;1．不要用手触摸纤维素膜； 2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛 面； 3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘 太近，不要重复点样； 4．膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极；;【思考题】 如果电泳结果证实γ球蛋白的分离效果不理想，应从哪些方面分析？;;【目的要求】 ①了解酶促反应的影响因素； ②掌握Km的意义和测定方法； ③了解底物浓度与酶活性的关系。;【实验器材】 1．可见分光光度计。 2．微量加样器。 3．0.025U/ml的酶液。;【方法步骤】;试剂;充分混匀后置室温10min，510nm波长下进行比色，以第8管做空白，测定各管的光密度。 【结果与分析】 1．计算各管酶活性单位。 D测/D标×0.01 2．计算各管[S]。 [S]＝加入[S]量/3.0×0.02 3．进一步计算出各管1/V和1/[S]。 4．将上述数据填入下表;数值 ;【注意事项】;【思考题】;—Folin-Wu法;1.掌握影响血糖含量的因素；2.熟悉测定血糖的原理和方法及临床意义；3.熟悉动物取血的基本操作。;【仪器试剂】 722型可见光分光光度计、血糖管、奥氏吸管、锥形瓶、注射器等；钨酸钠、