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卷柏中双黄酮类化合物的提取及含量测定 1 卷柏属植物的特性 柏树属植物是蕨类植物的一种丛生草本植物。中国大约有50多种柏树，产于全国各地[l]。它被广泛应用于止血活血、封闭止血、清热除湿、利尿消肿等疾病。现代药理及临床研究表明, 卷柏属植物具有抗炎、抗病毒、镇痛等作用。卷柏作为卷柏属的一种, 含有丰富的双黄酮类成分。此实验以卷柏为研究对象, 采用了不同溶剂对其中双黄酮类化合物进行提取, 应用HPLC法定量分析不同提取物中的穗花杉双黄酮的含量, 为卷柏属植物的研究提供实验基础。 2 实验部分 2.1 设备和材料 2.1.1 分析纯试剂和色谱超纯水 卷柏 (购于河北康辉药材有限公司) ;95.0%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯等分析纯试剂 (购于北京精细化学品有限责任公司) ;超纯水 (18.2ΩPa) (Young Lin Instrument) , 色谱纯的甲醇和乙腈 (购于美国Fisher公司) ;0.45μm滤膜 (安捷伦公司) 。 2.1.2 旋转蒸发仪 高效液相色谱为Agilent 1 100;N-1001旋转蒸发仪 (上海爱郎仪器有限公司) ;BS-124S电子天平 (德国) ;Elma-S180H超声清洗器 (德国) ;冻干机 (德国) 。 2.2 标准曲线的绘制 精密称取穗花杉双黄酮粉末, 用色谱甲醇配制成1 mg/m L的标准品贮备液, 储存于-20℃冰箱备用。 3 结果与分析 3.1 标准曲线的绘制 将1.0 mg/m L (1 000 ppm) 标准品储备液进行稀释, 7个不同浓度的穗花杉双黄酮甲醇溶液 (0.1~2.5mg/m L) , 经高效液相色谱检测, 以进入样品量为横坐标, 色谱峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线。穗花杉双黄酮标准曲线回归方程为Y=254190X-52.189, r=0.9998。 3.2 提取的穗花杉双黄酮含量 实验分别采用70.0%乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯以及正己烷作为提取溶剂, 应用超声提取法对卷柏中的双黄酮进行提取, 考察不通提取物中其含量, 结果如表1所示。从表1的数据中可以看出, 70.0%乙醇溶液所提取的穗花杉双黄酮的含量最高, 为14.051 mg/g, 而正己烷提取物中的含量最低, 为0.404mg/g。乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物中的含量相近, 分别为1.707 mg/g和1.718 mg/g。结果表明, 70.0%的乙醇溶液适合于卷柏中穗花杉双黄酮的提取。 4 提取溶剂的选择 以卷柏中的双黄酮类化合物为研究对象, 分别应用了4种不同的提取溶剂对其进行提取, 以穗花杉双黄酮作为标准物质, 应用RP-HPLC法绘制标准曲线, 对不同溶剂的提取物进行定量分析, 考察了不同溶剂对双黄酮类化合物提取效果的影响。实验结果表明, 70.0%的乙醇水溶液适合于卷柏中双黄酮类化合物的提取。 2.3 流动相和洗脱梯度 高效液相色谱为Agilent 1 100, 配备四元洗脱泵, 脱气阀, 自动进样器, 二极管阵列检测器, 柱温箱 (Agilent 1200) , 色谱柱为C18 250×4.6 mm, 5.00μm (Agilent, USA) 。流动相为甲醇 (A) 和0.2%醋酸水溶液 (B) , 所用溶剂都经过0.45μm滤膜过滤;流速为1 m L/min, 总的运行时间为25 min;液相的洗脱梯度为:0~5 min:70.0%B~40.0%B;5~10 min:40.0%B~20.0%B;10~22 min:20.0%B~10.0%B;22~25 min:10.0%B~70.0%B;进样量为10μL, 检测波长337 nm。