志贺氏菌CRISPR位点的比较基因组学及与质粒数量的相关性分析.docxVIP

? ? 志贺氏菌CRISPR位点的比较基因组学及与质粒数量的相关性分析 ? ? 曲道峰 陆诗铫 陈跃文 黄东萍 龚俏玲 易松强 韩剑众* （1 浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018 2 江西省畜牧技术推广站 南昌330046 成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）广泛分布于细菌和古生菌的基因组中，它是由RNA 介导的、可遗传的获得性免疫系统，与细菌水平基因转移关系密切，可以识别并剪切加工质粒等外源遗传物质，进而降低基因的水平转移。CRISPR 位点由重复序列和间隔序列组成，与前导序列、Cas 蛋白基因共同构成了CRISPR 系统[1]。重复序列保守性高，具有回文结构，能转录并形成RNA 二级结构，可以形成茎环结构[2]。间隔序列是高度可变的，研究发现噬菌体、大质粒等外源性可移动遗传原件是主要来源。前导序列和重复序列相互连接，当细菌体内产生新的间隔序列时，可以识别该新序列并启动转录产生前crRNA（CRISPR RNAs-）。在CRISPR位点附近存在CRISPR 相关蛋白质（CRISPR-associated，Cas）基因，可以编码Cas 蛋白，CRISPR/Cas 系统有3 个类型，即CRISPR/Cas 系统类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，依据Cas蛋白基因的差别每个类型可细分为几个亚类[3]。Haft 等根据cas 基因的相似程度将其分为45 个家族，在每个CRISPR 位点中都存在cas1 和cas2家族基因，可用这两个家族基因作为分子标记来鉴定CRISPR 系统[4]。 肠杆菌科经常是医学和科学界关注的重点和研究的热点，作为影响公共健康的一个重要标志，在公共卫生领域中对细菌食源性病原体进行深入研究意义颇深[5]。志贺菌属于肠杆菌科，是细菌性痢疾的病原体，同时也是一种最古老的人类特异性病原菌，有研究发现志贺菌属在35 000-170 000年之前就已经进化，与人类的起源和发展关系密切[4]。志贺氏菌根据O 抗原可分为4 种类型，分别为痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌[6]。在我国，福氏志贺氏菌比较常见，而基于CRISPR 系统特点的研究还比较少，且研究结果不一致[7]。本文主要比较和分析了40 株基因测序的志贺氏菌的CRISPR 位点，研究在不同志贺氏菌种中CRISPR 位点结构上的差异，对间隔序列与插入序列的同源性进行比较，判断CRISPR 位点与RNA 二级结构稳定性的关系[8]。 1 材料和方法 1.1 材料 从NCBI genome 数据库中获取40 株志贺氏菌的遗传信息和基因组全序列（http：///genome），其中包括6 株鲍氏志贺氏菌（Shigellaboydii），5株痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae）、18 株福氏志贺氏菌（Shigellaflexneri）以及11 株宋内氏志贺氏菌（Shigellasonnie）。基因组序列及其GenBank 编号见表1。 表1 40 株志贺氏菌基因组序列信息汇总Table1 The information of the genome sequence of 40 strains of shigella 1.2 志贺氏菌中CRISPR 位点分析 在CRISPRs Database（http：//crispr.i2bc.parissaclay.fr/crispr/）网站上查找并获取40 株志贺氏菌CRISPR 的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer），分析其CRISPR 位点的结构，同时在CRISPR Finder（http：//crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/）和CRT（CRISPR Recognition Tool）软件中进行查找预测[9]。 1.3 CRISPR 结构的核酸序列分析 将志贺氏菌的CRISPR 序列进行BLAST（https：///Blast.cgi）线上比对，利用Clustal X 软件进行多序列比对，通过CRISPR BLAST 和CRISPR Finder 对志贺氏菌的CRISPR 位点的重复间隔序列进行对比分析，再利用WebLogo 将CRISPR1～3，CRISPR-Q1～Q4 的重复序列进行可视化。 1.4 间隔序列的同源序列查找 将各菌种的间隔区提交到IS Finder 和INTEGRALL 网站进行在线比对，通过CRISPRs Database 数据库比对，寻找已有的间隔序列中的外源同源序列，以及新发现的间隔序列，分析间隔区序列的同源序列是否来源于外源DNA。使用BLAST 和CRISPRTarget 来分析间隔序列。 1.5 CRISPR 位点与RNA 二级结构稳定性的相关性分析 预测CRISPR 重复序列的RNA 二级结构