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青海弧菌q65在污水生物急性毒性检测中的应用 目前，主要的废水控制指标包括总氮（tn）、总磷（tp）、生化需氧量（bod）、化学需氧量（cod）、固体悬浮固体（ss）、总有机碳（toc）等。然而，这些物理和化学性质指标不能很好地反映排放的废水水质。虽然废水中含有的重金属和永久性有机污染物（pops）的含量较低，但它们的毒性较高，通常表现为导致癌、畸形和突变。目前，这种微有毒物质的检测方法包括原子吸收光谱、气相色谱、气质联合、高效液相层析成像等。然而，这些设备价格昂贵，技术要求很重，实验周期长。在一般的实验条件下，很难在室外进行检测这些物质。 水生生物对生态毒性的检测方法有:鱼类急性毒性实验、水蚤类毒性实验、藻类毒性实验、微生物毒性实验.其中,微生物毒性实验多采用发光细菌法.由于它的检测时间短、敏感性好、重现性好、费用低,对实验条件和实验场地要求较低,因而得到广泛的应用.发光细菌法与藻类、水蚤、鱼类等生物毒性监测具有很好的相关性. 青海弧菌Q67是我国发现的一种广泛应用于环境污染监测的淡水发光细菌.这种细菌已经用来检测环境中的重金属、抗生素、除草剂、杀虫剂和受污染的河流等水样[8~11].淡水发光细菌Q67与海洋发光细菌在生物毒性检测方面具有同样的有效性和可靠性.但是海洋发光细菌需要将测试水样调节成含Na Cl 2%~3%的水样.这可能改变了淡水样品中毒性物质的特性.因此海洋发光细菌对淡水样品的检测存在一定的局限性,而且大部分环境样品对青海弧菌Q67比对T3发光菌表现出更强的毒性. 与检测单种或2种化学品的生物毒性相比,天然水样具有成分复杂、干扰因素多等特点.这导致了水样生物毒性检测结果的不准确性.有的研究者指出,急性毒性实验可能低估了一些物质的毒性,特别是具有特殊作用方式的物质.对天然水样直接进行发光菌和藻类等毒性实验会受到共存物质刺激发光或刺激生长的影响.例如对NH4+-N或PO43--P含量高的水体,由于其刺激发光或作为营养物质的作用掩盖了毒性物质对发光细菌的作用,可能会导致错误的毒性实验结论.发光细菌毒性测试过程中的刺激发光现象主要是因为干扰因素的影响.所以对水样进行必要的前处理对提高检测结果的准确性具有重要意义.本研究的目的是采用发光细菌检测污水厂各处理单元进出水的生物急性毒性,并对污水生物毒性检测的影响因素进行了初步分析.这对污水处理与回用过程中,水体生物毒性的准确判断具有重要的实际意义. 1 材料和方法 1.1 生物毒性测试 污水来源于以Orbal氧化沟为主要处理工艺的某污水厂各处理单元的进出水.选取的5个取样点分别为细格栅出水、氧化沟进水、氧化沟出水、终沉池出水、UV消毒出水.污水处理工艺流程及取样点如图1所示. 水样取回后,采取如下处理方法:(1)用滤纸过滤后立即进行生物毒性测试;(2)水样经滤纸过滤后,分别放置1~5 d,然后分别进行生物毒性测试;(3)水样取回后用0.45μm微滤膜过滤后放置1 d,然后进行生物毒性测试;(4)高压灭菌后放置1 d,然后进行生物毒性测试;(5)采集的水样经过0.45μm的微滤膜过滤后,用C18固相萃取小柱(500 mg 3 m L PK54)富集有机物,具体操作如下:依次将7 m L的二氯甲烷、甲醇、纯水通过固相萃取小柱进行润湿活化,中间不允许填料抽干.水样经0.45μm滤膜过滤后上样,使水样连续通过SPE柱,调节真空泵的真空度,使液滴1 s左右滴一滴.水样全部过滤完后再用5 m L纯水洗涤,继续真空抽气干燥15 min.将SPE柱放在离心机中离心15 min,转速4 000 r/min.最后用二氯甲烷洗脱柱子,收集洗脱液,用高纯氮气吹干,用0.5%的二甲基亚砜溶解后用于生物毒性测试.实验中使用的0.45μm滤膜需在超纯水中煮沸然后使用,并在过滤时弃去前半部分滤样. 1.2 kcl/aclo 青海弧菌Q67(购自北京滨松光子技术股份有限公司)的培养采用可以得到较高菌生物量和对菌内荧光酶含量有利的培养基.培养基成分为:胰胨0.5%,酵母膏0.5%;甘油0.3%;Mg Cl20.32%;KBr 0.02%;Ca SO40.01%;Na Cl 0.4%;KCl 0.4%;p H 8.5±0.5,培养温度为22℃±1℃.培养时间10~12 h.细菌生长曲线如图2所示. 将4℃保存的青海弧菌Q67斜面菌种转接到50m L液体培养基中,22℃培养10~12 h达到对数中后期.起始菌液浓度在200万~600万RLU之间.在1.5 m L样品管中加入500μL样品溶液(每组3个平行,每一组样品前设一个空白),50μL菌悬液,每次加菌液时间间隔20 s,15 min后(精确到秒)将样品管放入ModulusTM单管型多功能检测仪(美国Turner Biosystems公司)上进行发光强度检测.