放射免疫分析.ppt

放射免疫分析;体外放射分析技术;;第三章 放射免疫分析;放射免疫分析的创立;1959年，Yalow和Berson创立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年获得诺贝尔生物医学奖。 这种方法结合了放射性核素测量的高灵敏性和免疫抗原-抗体反应的高特异性两大特点，开创了生物活性物质微量测定技术的先河。;基本原理;在上反应式中： Ag与Ag*的免疫活性相同，即与Ab有相同的亲和力； Ab的结合位点数＞Ag或Ag*，但＜Ag+Ag*； Ag*与Ab的量是恒定的，Ag是待测量。;二种抗原(Ag 、Ag*)与Ab结合的量取决于两者的浓度比例，Ag量多，则AgAb结合多，Ag*Ab结合量就少，即Ag*Ab将随Ag的增加而减少，呈负相关，表现为函数关系。在系统中，Ag*Ab的量可通过测定放射性而获得，再根据函数关系求Ag的量。;;标准曲线;标准曲线实例;标准曲线:;放免分析基本条件; a. 概念：是指已知真实含量，且不含对免疫反应产生干扰杂志的抗原。 b. 用途： 免疫动物制备抗体——Ab 放射性核素标记——Ag* 绘制剂量反应曲线 c. 要求： 高纯度 高准确度 良好的稳定性 ;（二）特异性抗体 ;b. 抗血清的制备： 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。 2．选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。 3．应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +卡介苗）。 4．选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数。 ; c.单克隆抗体的使用：;对标记抗原的要求： 1．放射性比活度高：即单位物质的放射性强度高，一般至少达到370GBq/mmol。 2．免疫活性：与标记前一致。 3．放射化学纯度高：应 95%。 4．稳定性好：标记的同位素不易脱落。; 常用标记核素： （1）125I： γ 射线，半衰期 60 天 （2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年 测量仪器： （1）γ 计数仪 （2）β液体闪烁计数器 ;两种标记方法的优缺点;a. 对分离方法的要求： 1．使抗原-抗体复合物（B）与游离抗原（F）尽可能分离完全； 2．分离后便于放射性测量； 3．分离效??不受外界干扰因素的影响； 4． 操作简便、分离迅速、重复性好； 5．与游离标记物的非特异性结合尽可能小； 6. 试剂来源广泛、价格低廉。 ; b. 常用的分离方法 1. 双抗体法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但分离时间长，成本高。; 2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 3. 双抗体PEG法 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点。;4．固相分离法 将抗体通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的Ag-Ab?复合物，可与游离部分分离。 此方法具有操作简便，迅速，分离效果好，非特异性结合低等优点。 ;2020/11/4; 5.磁化分离法 6.葡萄球菌A蛋白分离法（SPA分离法） 7. 微孔滤膜法 ;放免分析的优点;第三章 放射免疫分析;1968年，Miles和Hales创立了免疫放射分析法（IRMA）。 IRMA与IRA不同，它是将放射性核素标记在抗体上，而不是标记在抗原上。同时所用的标记抗体与待测抗原比较是过量的。 Ag+Ab* Ag-Ab*+Ab* B F 由上式可见， IRMA不存在竞争反应，是待测抗原直接与标记抗体反应。待测抗原的量与抗原-标记抗体复合物的量成正相关关系。 ;1.单位点IRMA;2.双位点IRMA;竞争性分析与非竞争分析的比较;第三章 放射免疫分析;放射免疫分析技术的临床应用;一 甲状腺疾病;临床上确诊为甲状腺功能亢进的步骤;临床上确诊为甲状腺功能减退的步骤;二 代谢类疾病;人真胰岛素(insulin specific) 不经处理的血浆，通过放免法测得的胰岛素称为免疫反应性胰岛素（IRI），IRI与胰岛素原有明显的交叉反应，当血清中胰岛素原含量较高时，应考虑对胰岛素测定的影响。 人真胰岛素放免分析可特异性测定人血清中与胰岛素原无交叉反应的胰岛素水平，是确切评价β细胞功能和胰岛素敏感性的关键指标。;三 骨和矿物质代谢;降钙素（CT）和甲状旁腺激素（PTH） CT及PTH参与钙稳态调节机制：当血钙降低时，PTH分泌增加，作用于骨促进溶骨