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易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶的中期报告 一、简介 PCR定向进化技术是一种基于现代分子生物学的定点突变和筛选方法，在不改变大部分蛋白质序列的情况下，通过引入局部突变以达到改善蛋白质性质的效果。本次实验旨在根据已知的青霉FS1884脂肪酶基因序列，通过PCR定向进化扩展该酶的催化活性和耐受性，并利用筛选方法寻找出突变后的优良结构。 二、实验流程 1. 温度梯度PCR扩增 将FS1884脂肪酶基因序列引入温度梯度PCR反应体系中，调节温度梯度使扩增产物与基因序列匹配程度高。使用不同突变体和模板DNA作为反应组，扩增出多个长度相近的DNA序列片段。 2. 定向进化突变法 将PCR扩增产物和限制性内切酶进行切割，获得固定长度的DNA片段。使用定向进化突变酶对这些片段进行定向点突变，引入新的催化位点，试图改善脂肪酶性质。 3. 再次PCR扩增 将定向突变的DNA片段作为模板进行PCR扩增，选用合适的引物，将定向突变扩增到目标长度。 4. DNA克隆 将突变后的DNA片段插入到原有FS1884脂肪酶基因序列中，并将其转化为大肠杆菌中并进行筛选。 5. 筛选 通过在含有特定底物的固体培养基中筛选出表达高、活性强的脂肪酶突变体。 三、结果 根据实验数据，对多个不同的PCR扩增产物进行限制性内切和定向进化突变，成功引入了新的催化位点。选取8个优秀的脂肪酶突变体进行再次PCR扩增，克隆进大肠杆菌中进行筛选。经过比较，成功获得了一种表达量高，催化活性提高2倍的脂肪酶突变体。 四、结论 本实验利用PCR定向进化技术扩展了青霉FS1884脂肪酶的催化活性和耐受性，并通过筛选方法获取到一种表达量高，催化活性提高2倍的脂肪酶突变体。这种方法可以作为类似脂肪酶的酶类分子调整性质的重要工具，也为进一步调整脂肪酶分子的催化性质提供了有益的借鉴。