苯酚-硫酸比色法测定多糖的研究.docxVIP

苯酚-硫酸比色法测定多糖的研究 随着生物药物、天然药物和保健品的深入研究，山羊的研究成果迅速发表。目前多糖含量的测定方法尚无统一标准, 广泛应用的是苯酚-硫酸比色法。该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点, 且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。 1 糠醛衍生物的测定 苯酚-硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等提出的。其原理是:多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解, 产生单糖, 并迅速脱水成糠醛衍生物, 该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应, 生成橙黄色物质, 在波长490nm处和一定浓度范围内, 其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系, 从而可用比色法测定其含量。 2 实验方法 2.1 标准溶液的制备 精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖约100.0mg, 置100m L量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 配得葡萄糖标准溶液。 2.2 试验溶液的制备 将样品进行适当处理 (如真空干燥、回流提取等, 根据各品种不同而有差异) , 取适量, 按一定比例稀释, 配制供试品贮备液。 2.3 馏分的收集 称取苯酚100g, 加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g, 常压蒸馏, 收集 (180±2) ℃馏分。精密称取该馏分约10.0g置于200m L量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀后转置于棕色试剂瓶中, 即得苯酚溶液, 将其置于冰箱中备用。 2.4 条件选择 2.4.1 浓硫酸水浴加热试验 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各1.0m L于100m L量瓶中, 用水稀释至刻度, 分别作为供试品溶液和对照品溶液。分别吸取供试品溶液1.0m L于两个具塞试管中, 各加苯酚液1.0m L, 并分别迅速滴加浓硫酸5.0m L。一份于水浴中煮沸15min, 另一份于40℃水浴中恒温30min。另取两份对照品溶液1.0m L同上操作。取出, 冷却至室温, 15min后于490nm处测其A值, 选取A较高的作为实验温度。 2.4.2 浓硫酸加入量a与c的反应 分别吸取供试品液和对照品液1.0m L5份, 各加入苯酚液0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0m L, 加水至2.0m L, 再各滴加浓硫酸5.0m L, 40℃恒温30min后, 测其A值, 从苯酚液加入量达到某一值开始, A值基本保持不变, 说明苯酚液量达到该值以上时, 反应都能完成。另取供试品液和对照品液0.6m L各5份, 分别加苯酚液1.0m L, 再分别滴加浓硫酸2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0m L, 并均用水稀释至8.0m L, 根据A的稳定性, 计算硫酸的最佳加入体积。 2.4.3 浓硫酸溶液 分别取供试品液和对照品溶液1.0m L4份, 各加苯酚液1.0m L, 浓硫酸5.0m L, 于选定温度分别恒温10, 20, 30, 40min。测得A值, 加热到一定时间以后, A值不再变化, 说明加热该时间即可使反应完全。另测反应完成后样品在不同时间内的A值, 结果应在1h以上稳定。 2.5 最大波长的测定 依据2.4确定的测定条件, 精密吸取葡萄糖标准生物药物 溶液0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8m L (相当于葡萄糖0.0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800ug) , 分别置于10m L具塞刻度试管中, 各加水使成1.0m L, 然后分别加入苯酚溶液, 摇匀, 迅速加入浓硫酸, 振摇5min后置相应温度水浴中加热一定时间, 取出置冷水中冷却, 最后加水至刻度, 摇匀。用分光光度计在波长490nm处测定吸光度。以A值对浓度C绘制标准曲线, 进行线性回归, 得标准曲线方程:A=a·C+b (a、b根据实验确定) 。 2.6 复合多糖含量的测定 将样品多糖纯品适量, 按适当比例稀释, 使单糖浓度在标准曲线中C范围内, 作为纯品贮备液。精密吸取该贮备液100ul, 照标准曲线制作项下的方法测定A, 求出样品多糖的浓度C (ug/m L) , 按f=W/ (C·D) 计算换算因子。式中W (ug) 为多糖含量;D为纯品的稀释倍数。若样品多糖无纯品, 如可能进一步纯化, 则将样品进行提纯后用于测定校正因子。 2.7 多糖含量测定 取样品适量, 精密称定, 稀释, 按照2.5中条件进行测定, 得到多糖浓度C, 按多糖含量 (%) =[ (C·D·f) /W样]×100%计算多糖含量。式中W样为样品重量;D为样品的稀释倍数;f为换算因子。 3 讨论 3.1 采用分光光度计测定糖的方法，操作简单，结果稳定，灵敏度高 3.2 标准曲线a值的保持 备液用量, 可根据实际情况进行调整, 使A值保持在灵敏范围内, 保证样品浓度在标准曲线C范围内, 以免测定结果偏离真实