DB42T 1438-2018甘薯品种真实性鉴定 ISSR法.pdfVIP

ICS 65.020.99 B 04 备案号： DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1438—2018 甘薯品种真实性鉴定 ISSR法 Verification of genuineness for sweetpotato—ISSR （报批稿） 2018 - 09 - 11 发布 2018 - 12 - 10 实施 湖北省质量技术监督局 发 布 目 次 前言 III 1 范围 1 2 术语和定义 1 2.1 聚合酶链式反应 1 2.2 简单重复序列区间 1 2.3 引物 1 3 甘薯品种真实性鉴定 1 3.1 DNA 提取 1 3.2 ISSR 扩增 1 3.2.1 反应体系 2 3.2.2 反应程序 2 3.3 PCR 产物的电泳检测 2 3.4 数据记录 2 3.5 结果分析 2 附录A （资料性附录） 引物清单 3 附录B （资料性附录） 湖北省主栽品种相应指纹图谱 4 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由湖北省农业科学院提出。 本标准由湖北省农业科学院归口管理。 本标准起草单位：湖北省农业科学院粮食作物研究所。 本标准主要起草人：杨新笋、王连军、雷剑、苏文瑾、柴沙沙、焦春海、宋峥。 甘薯品种真实性鉴定ISSR 法 1 范围 本标准规定了甘薯品种真实性鉴定ISSR 法。 本标准适用于湖北省甘薯品种和种质真实性的鉴定，包括地方品种、选育品种、品系和国外引进种 质资源。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 2.2 简单重复序列区间 inter-simple sequence repeat, ISSR 是在PCR 技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法，根据某个简单重复序列（微卫星位点） 设计出一系列特异引物，通过PCR 反应扩增微卫星位点间隔的碱基序列，以检测其扩增片段长度的多 态性。 2.3 引物 primer 复制起始时为 DNA 聚合酶提供游离的 3’羟基作为复制起点的物质，体内 DNA 复制引物一般是 RNA ，有时也可以 DNA 或者蛋白质替代；体外引物是一段DNA 。 3 甘薯品种真实性鉴定 3.1 DNA 提取 采用SDS 法：取甘薯种薯幼苗新鲜幼嫩叶片0.2g 于研钵中，加液氮速冻后立即研磨成粉末。转移 粉末至预冷的1.5 mL 离心管中，加入400μL 预热至65℃的SDS 提取缓冲液（含有2%体积的β-巯基乙 醇）、100 μL 的10% SDS，然后65℃水浴20 min ，其间轻轻颠倒混匀数次。10000 rpm 离心10 min。取 上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 ），颠倒混匀，10000 rpm 离心10 min。取上清加入2 倍体积 的无水乙醇（-20 ℃预冷），颠倒混匀，-20 ℃放置1 h。用带有弯钩的玻璃毛细管将絮状的DNA 钩出来 放入70%的乙醇中，洗涤2 次，空气干燥30 min 。溶解在100 μL 灭菌去离子水中，-20 ℃保存。 注：以上为推荐的DNA 提取方法。其他能够达到PCR 扩增质量要求的DNA 提取方法都适用于本 标准。 3.2 ISSR 扩增 3.2.1 反应体系 模板DNA 1μL，引物2μL （10μM ），10×Easy Taq Buffer ，dNTP