沉淀反应PPT课件-----精品课件下载.pptVIP

编辑版ppt 3. 抗体稀释度 　　抗体浓度易小，因相应沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，方法敏感度较高。 　　但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。 　　因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。 4. 扩散时间与温度 　扩散时间赿长，扩散温度在4-37℃范围内，升高温度，反应时间缩短。 　　　注意扩散要达到终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长。 5.每次都要做标准曲线，并必须加测质控血清； 6.双环现象（重链病）； 7.单克隆抗体测正常人多态性抗原，则抗体相对过量，结果降低； 8. 多克隆抗体测定单克隆蛋白，则抗原相对过量，结果增加。 (四) 方法评价 一种简便、实用的定量方法； 不需特殊仪器制备； 灵敏度稍差为1.25mg/L； 耗时长,影响因素多（操作规范时，重复性和线性尚可依赖），目前临床中少用。 (一) 原理： Ab Ag 染色标本图 1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧 二、双向琼脂扩散试验 (double gel diffusion test) (二) 操作步骤 　　　　制板 1.5%琼脂、4ml／每片 　　　　打孔 孔径3mm，孔间距3~5mm 　　　　加样 　　　　孵育 37℃、24-48h 应用 (三)　双向琼脂扩散试验的应用 抗原或抗体的有无及纯度； 估算抗原及抗体的相对含量及相对分子量； 分析抗原的性质； 滴定抗体的效价。 4.抗原抗体纯度鉴定 “1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。 1.检测未知抗原或抗体 Ag Ab A B C D E F A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ； D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ； 2表示标准Ag 1表示待检Ag 待检Ag与标准抗原完全吻合； 待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应； 待检Ag有与Ab相对应的Ag，但与标准Ag不同； 待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低； 1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。 1. 原理 入射光I0 透射光I 吸光度A=lgI0/I＝k1bC复合物 C复合物＝k2C抗原(抗体过量) 二) 免疫胶乳比浊法 吸光度A ＝k3C抗原 2. 技术要点 稀释待检样品和标准品 加抗体致敏胶乳溶液　　　　　 　　 　　　　　孵育一定时间 测定吸光度(A340nm)值 制备剂量-反应曲线 A吸光度 抗原浓度 　标准曲线 3. 方法评价 ： 敏感度高（达ng/L）； 稳定、可靠，特异性好； 不需特殊仪器设备；　 血清中的 RF可与IgG Fc段结合，使IgG致　 　　敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2 　　片段代替IgG既可消除此干扰。 代表性仪器： 普通分光光度计 自动生化分析仪：olympus AU560 三) 散射比浊法 I0入射光 散射光　I α（5°—96°） I＝　I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cos α)］ Nγ2λ4 散射光强度 颗粒含量 正相关 颗粒大小 正相关 入射光波长 负相关 测量散射光的角度 正相关 颗粒直径＜＜入射光波长 颗粒直径＞或＝入射光波长 散射角度尽可能大：提高灵敏度；排除大颗粒的干扰 第一阶段 第二阶段 速率散射比浊 终点散射比浊 I0入射光 I＝K1C复合物 散射光　I α（5°—96°） C复合物＝K2C抗原 （Ab浓度恒定） I＝K3C抗原 1.原理：抗原与过量抗体反应达到平衡时，形成复合物不再增加，并在形成絮状沉淀前，测定此时的溶液浊度。 抗原抗体作用30-120min内比浊，形成较小复合物 （一）终点散射比浊法 2. 技术要点 稀释待检样品和标准品 加最适工作浓度的抗体 　　　　　孵育 测定散射光强度 I（450nm ） 绘标准