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大蒜素和它的前药对食管癌细胞eca二十三六分增殖抑制及凋亡基因表达的影响 近年来，肿瘤的发病率和死亡率有上升趋势，这是一种普遍而重要的疾病。食管癌是人类消化道的常见肿瘤, 我国每年因食管癌死亡者约15万人, 占癌症患者死亡率近1/4, 位居第二位。我国抗肿瘤药物近10年来取得了令人瞩目的成就。现能生产的抗肿瘤药物 (不含免疫调节剂) 包括:烷化剂类、抗代谢药、天然抗肿瘤药、抗肿瘤抗生素等, 但多数抗肿瘤药物存在毒副作用较大, 疗效不稳定、复发率高等问题。因此, 寻找一种低毒、疗效稳定、使用方便且具有广谱抗肿瘤活性的药物成为抗肿瘤药物研究和临床中亟待解决的问题。肿瘤的中药治疗是当今临床治疗的重要手段之一, 中草药及其活性成分抗肿瘤药物的研究和开发已成为人们关注的热点, 我国具有1 000多年中草药研究的悠久历史, 有很多的古代偏方和有名中医的经验方, 开发中草药抗肿瘤药物具有广阔的发展前景。 大蒜Allium sativum L.是历史悠久的药食两用植物, 早在4 000多年前人们就开始食用大蒜, 并用大蒜治疗疾病。大蒜的多种药理作用主要源于它所特有的有机含硫化合物, 如蒜氨酸及其分解产物大蒜素等, 大蒜组织损伤时释放蒜氨酸酶 (Alliinase) , 蒜氨酸酶催化蒜氨酸缩合形成具有强烈辛辣味的挥发性大蒜素 (Allicin, 主要成分是二烯丙基硫代亚磺酸脂) 。大蒜素遇光、热容易降解成二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物 (DADS) 等含硫有机化合物。近年来国内外研究表明, 大蒜素对胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等癌细胞有明显抑制作用。发现大蒜素通过抑制肿瘤细胞的增殖, 影响细胞周期, 诱导肿瘤细胞凋亡, 对抗癌药具有增敏作用等抑制或杀死肿瘤细胞。大蒜素生物半衰期短 (t1/2=2.32 h) , 理化性质不稳定, 在常温下可进一步分解, 引起分子中二硫键断裂, 降解成各种化合物, 如阿藿烯类 (ajoenes) 、乙烯基二硫杂苯类 (vinyldithiins) 和硫醚类 (sulfides) 等有机硫化合物, 导致活性大大降低, 影响其药理作用及疗效。大蒜素前药 (蒜氨酸和蒜氨酸酶) 较稳定, 本实验通过比较大蒜素及大蒜素前药对食管癌Eca9706细胞的增殖抑制作用, 以及检测bcl-2、bax、survivin、caspase-3和p53基因在转录水平的变化, 为探讨大蒜素及其前药诱导食管癌凋亡的分子机制及抗肿瘤治疗提供可靠的依据。 1 菌株和生物资源 Real Time PCR检测系统 (Applied Biosystems7500型, 美国) ;凝胶成像系统 (Alpha Innotech Corporation TM-26型, 美国) ;真空冷冻干燥机 (Christ Alpha 1-2 LDplus型, 德国) ;倒置显微镜 (江南XD-101型, 中国) ;酶标仪 (Feic Benchmark Plus型, 美国) ;CO2细胞培养箱 (Heal Force HF240型, 中国) 。 新鲜大蒜 (本地购买) , 人食管癌Eca9706株由郑州大学基础医学院董子明教授馈赠, 新疆生物资源基因工程重点实验室保存。 蒜氨酸 (Sigma) , 二烯丙基二硫化物 (DADS, 纯度为80%, Sigma) 。RPMI1640培养基、0.25%胰酶消化液、二甲基甲砜 (DMSO) 、四甲基硝唑蓝 (MTT) 、胰酶和10%胎牛血清 (鼎国昌盛生物技术有限责任公司) ;青霉素和链霉素 (ICN Biomedicals公司) 、引物 (上海生工生物技术有限公司) ;Trizol RNA提取液和SYBR Green Supermix kit (Invitrogen, 上海普飞生物技术有限公司) ;Tag DNA聚合酶、DnaseⅠ、d NTP、RNAse抑制剂、Oligo (d T) 、Reverse Transcriptase M-m LV (RNase H-) 和DNA Marker (均为大连Ta KaRa公司产品) ;其它试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 大蒜素的测定 大蒜素提取方法参照曾哲灵方法进行, 得到的大蒜素冷冻干燥, 大蒜素干粉得率为2.41 g/kg。大蒜素测定参照DTNB比色法进行, 测得大蒜素质量浓度为0.3μg/m L。称取大蒜素干粉45 mg溶于5 m L RPMI1640培养液, 配置质量浓度为9 mg/m L, 过滤除菌, 置-20℃冰箱保存。临用前用RPMI1640培养液分别稀释至5、10、15、20、30μg/m L。 2.2 蒜氨酸酶活力测定 称取新鲜去皮蒜瓣200 g, 4℃预冷, 加入预冷的磷酸缓冲液200 m L (蒜瓣∶提取液=1∶1, W/V) , 匀浆。匀浆液在4℃低温下