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pegdexxxran双水相体系中bsa的分配特性 与传统的溶剂提取相比，双水相萃取最大的优点是，在双水相系统的帮助下，生物活性物质可以提供一个温和的环境，并在萃取过程中保持生物活性和结构。此外，双水相萃取还具有收率高、成本低、连续化操作等优点。现被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取,尤其在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化方面更是备受关注。在蛋白质的分离纯化中,常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)和PEG/盐两类体系。由于PEG/盐体系的选择性不高,且易导致蛋白质变性。故本文选择PEG/dextran双水相体系进行研究,以BSA为模型蛋白,考察该体系表面性质、电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素对BSA分配的影响。同时选择出双水相体系合适的高聚物分子量与浓度, 并对各影响因素进行系统研究,以确定最佳操作条件,得出合适的(较小的) 分配系数,从而达到使BSA在dextran富集的下相分配的目的。 1 实验部分 1.1 上海西南大南油公司致东南方提供了单一设备的“支持” 聚乙二醇规格分别是1000、4000、6000 、10000,分析纯,均由上海浦东高南化工厂提供;牛血清白蛋白、葡聚糖(分子量40000) 均由Pharmacia公司提供, 其它试剂均为市售分析纯。 1.2 实验设备 TGL-16G数显高速离心机,江苏城西晓阳电子仪器厂提供;UV762紫外/可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司提供。 1.3 实验方法 1.3.1 peg溶液的配制 根据Albertsson的方法绘制相图:将已知浓度的dextran溶液逐滴加入PEG的浓溶液中,直到出现浑浊。记下此时的体系组成并向PEG溶液中加入1 g水,摇匀待溶液变清后重复上述操作。将所记录的体系组成以PEG浓度为纵坐标, dextran浓度为横坐标作图即得到双结点曲线(图1)。 1.3.2 中性盐的制备 移取一定量的PEG原液、dextran原液以及BSA原液。当需考察盐和缓冲液的影响时,可加若干固体中性盐和磷酸盐缓冲液,最后用去离子水补足至2 g,上下倒置多次使其混匀后,室温下静置5 min,再用3000 r·min-1离心10 min至两相分离,在25℃水浴中放置12 h。 1.3.3 分配系数的测量 上、下相分别取样,用考马斯亮蓝G250染色法测定BSA浓度,分配系数为上下相BSA浓度之比。 2 结果与讨论 2.1 bsa在双水相体系中的分配 在PEG4000/dextran双水相体系中,选择了4种浓度,即对应4条长度不等的结线(保持PEG4000质量分数9%不变,改变dextran浓度),进行BSA分配试验,如图2所示(图中线段AB为PEG4000/dextran双水相体系的一条结线的示意图,A、B两点坐标分别对应于双水相体系上下相组成)BSA在各浓度体系中的分配系数见图3。由两图可知,随着dextran质量分数的增加,结线长度增加,同时分配系数降低,且均小于1;BSA在具有较长结线的双水相体系中分配系数较低。原因是BSA的表面性质决定了它易于在dextran富集的下相分配,且界面张力随结线长度呈指数规律的增加,导致体系中所有粒子的迁移中,上相中的BSA受界面吸附的影响不断向下相分配占优势。 2.2 peg4000/dexran双水相体系的优化 由4种分子量的PEG形成的双结点曲线见图1:在曲线右上方,双水相体系分相;在曲线左下方, 体系不分相;双结点曲线随着PEG分子量的增加更 加靠近原点。这是由于两相间的差异逐渐增大,分相所需的PEG和dextran的浓度也随之降低。在PEG质量分数9%-dextran质量分数9%的浓度组成下,BSA在由PEG1000、PEG4000、PEG6000、PEG10000所形成的4种双水相体系中的分配系数见图4。随着PEG平均分子量的增大,分配系数减小,这是因为PEG的端基数目减少,疏水性增加,从而使亲水性蛋白BSA向下相富集。对于PEG1000在此组成浓度下没有分相,这同样可从图1中理解(该点在双曲线以下的单相区内),本质原因是PEG1000与dextran间的相互排斥作用较其混合过程的熵增加弱。为降低系统黏度和节约原料,优先选择结线长度较短的PEG4000/dextran双水相体系进行研究。 由图5可知,中性盐的种类不同,分配系数各不相同。原因是这些电解质的阴阳离子在两相间有不同分配,由于受电中性的约束,产生不同的相间电位。结果表明,带负电荷的BSA,添加NH4+较添加Na+可得到较低的分配系数。对于阴离子按下列顺序降低其分配系数: Ac-SO42-citrate3-Cl-。由实验知,添加NaCl可得较小分配系数,故选用NaCl进行以下分析。 2.3