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土壤蔗糖酶活性测定
1.原理
采用3,5-二硝基水杨酸比色法。该方法以蔗糖为基质,基质在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄糖,葡萄糖和3,5-二硝基水杨酸反应生成橙黄色的3-氨基-5-硝基水杨酸,并在508nm波长下有最大吸光值。
2.测定方法
①称取壤土0.15g、砂土0.3g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中,加入0.06 mL甲苯和1mL ph5.5磷酸缓冲液,再加3mL 8%蔗糖溶液,摇匀后加盖,放进36~37℃的培养箱中进行培养24个小时;
②培养完成后取出,摇匀,并于4000r/min离心5min;
③取上层清液0.2ml于20ml玻璃管中,并加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸,再立即将玻璃管沸水浴中加热5min,加热完毕后在自来水流下冷却3min;
④将显色液体用蒸馏水稀释到5ml,在508nm波长下比色,记录吸光值。
3.蔗糖酶标准曲线的测定方法
(1)葡萄糖标准溶液的配制
a.饱和苯甲酸溶液的配制
在洁净的烧杯中加入适量蒸馏水,慢慢加入少量苯甲酸同时用玻璃棒搅拌,直至苯甲酸溶解的同时出现析出的苯甲酸晶体为止。
b.标准葡萄糖溶液的配制
称取500mg葡萄糖溶解于适量苯甲酸饱和溶液中,并取100ml容量瓶用苯甲酸饱和溶液定容(5mg/ml)。
(2).操作步骤
a.取11支洁净20ml玻璃管编号0—10。
b.按下表加液
编号:0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10葡萄糖母液(ml)0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07饱和苯甲酸(ml)0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13葡萄糖浓度(mg/ml)0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07吸光值(A508nm)0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.006 1.176c.在玻璃管中各加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸溶液,并立刻放入沸水浴中加热5min.加热后,立刻将玻璃管在流动自来水下冷却3min.冷却完毕后,用蒸馏水定容至5ml.d.将显色液在508nm波长下比色。
4.计算
蔗糖酶活性以24h后1g土壤中含葡萄糖的mg数表示。
葡萄糖(mg)=a×100
a—从标准曲线查得的葡萄糖mg数
100—换算系数
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