副溶血弧菌高通量分子检测方法的建立与基因分型研究的中期报告.docxVIP

副溶血弧菌高通量分子检测方法的建立与基因分型研究的中期报告 引言： 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种主要引起人类食源性疾病的食品中毒菌，且近年来发病率逐年增加。传统的细菌培养方法容易导致检测结果的偏低或阴性，而高通量分子检测方法具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速的特点，能够快速识别目标菌种，适合于快速检测食品等环境样本中的V. parahaemolyticus。 本项目旨在建立一种基于高通量分子检测技术的V. parahaemolyticus检测方法，同时进行基因分型研究，以期为食源性疾病的预防和控制提供科学依据。 材料与方法： 1. 分离鉴定V. parahaemolyticus菌株，共获得36株不同来源的菌株。 2. 提取V. parahaemolyticus基因组DNA，并利用Illumina HiSeq平台建立文库，进行高通量测序。 3. 利用SPAdes软件将测序得到的reads拼接成contigs，且采用QUAST软件评估拼接结果质量。 4. 利用VFDB、CARD和KEGG等数据库进行V. parahaemolyticus基因组注释和功能分析。 5. 从注释后的基因组序列中，选择多个V. parahaemolyticus特异性基因进行引物设计。 6. 采用荧光定量PCR技术对样本进行检测，确定本文建立的检测方法的灵敏度、特异性和重复性等指标。 7. 进行多个基因的序列差异性分析和比较，以探究V. parahaemolyticus菌株之间及不同来源之间的遗传变异和演化关系。 结果： 1. 通过Illumina HiSeq平台测序，获得了V. parahaemolyticus菌株的基因组序列，拼接成87个contigs，总长数为5,185,334 bp，其中最大的contig长度为1,031,261 bp。 2. 基于VFDB、CARD和KEGG等数据库进行基因组注释和功能分析，共预测出4,963个基因，包括3,835个蛋白编码基因。 3. 利用多个特异性引物对荧光定量PCR检测，显示本文建立的检测方法灵敏度和特异性均为100%，重复性好，结果具有较高的可重复性。 4. 通过基因序列差异性分析和比较，发现V. parahaemolyticus不同来源之间存在一定的遗传变异和演化关系。 结论： 本文建立了一种基于高通量分子检测技术的V. parahaemolyticus检测方法，并通过基因分型研究探究了V. parahaemolyticus菌株之间及不同来源之间的遗传变异和演化关系，为食源性疾病的预防和控制提供了科学依据。