人型前胶原含量测定的ria法及其在肝硬化诊断中的应用.docxVIP

人型前胶原含量测定的ria法及其在肝硬化诊断中的应用 1992年，作者从流行性出生的皮肤中提取并提取了i类原羟基（hpc），建立了血清hpc的ria法，并在临床上推广。但由于技术条件限制, 受提取抗原活性及抗体效价、亲和力的影响, 操作繁琐, 时间长, 不利于临床使用。1996年作者改善了抗原的提取和抗血清的制备工艺, 改进了hPCⅢ RIA, 现报道如下: 材料和方法 1 高盐废水浓缩 取4-6个月人流胎皮, 制成匀浆。在4℃用内含蛋白酶抑制剂的Tris-HCl pH7.4缓冲液, 提取48h。离心, 上清液加硫酸氨盐析。低温高速离心, 沉淀溶解后盐析, 超速离心。沉淀溶解透析除盐、浓缩。采用中压层析系统, 上DEAE-32纤维素柱层析除去酸性糖蛋白, 再经DEAE-52纤维素柱梯度洗脱, 收集第二峰, 并在1‰醋酸溶液中透析除盐, 浓缩即得hPCⅢ, 于-85℃备用。 2 蛋白质标准品 将hPCⅠ、hPCⅢ, 牛PCⅢ、Ⅲ型胶原标准品, 由Sigma公司提供;高分子量蛋白质标准品, 由Pharmacia公司提供。经β巯基乙醇还原、用5%凝胶作SDS垂直平板电泳。 3 hpca免疫 取300μg hPCⅢ与等量完全福氏佐剂乳化后, 于皮内背部两侧多点注射免疫家兔。每隔两周用200μg hPCⅢ追加免疫, 两个月后耳静脉取血, 测抗血清效价。最后颈动脉放血, 分离血清-85℃冷冻