脂肪酶酶活测定方法.docxVIP

脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、 食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂） 脂肪酶活力定义 为 1g 固体酶粉（或1mL 液体酶），在一定温度的pH 条件下，1min 水解底物产生 1μmol 的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以 u/g（u/mL）表示。 测定原理 脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用 pH 计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为： RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。 仪器设备 恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH 计，电磁搅拌器 试剂溶液 95％酒精 4%聚乙烯醇（PVA，聚合度 1750±50）：称取 4g PVA，加蒸馏水 80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解， 慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至 100mL，用双层纱布过滤后备用。 橄榄油(分析纯) 底物溶液：按 4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1 比例混合，用高速匀浆机处理 6min（分两次处理，间隔 5min，每次处理 3min）。pH7.5 磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠 39.62g，磷酸二氢钾 1.96g，用水溶解并定容至 500mL，调节溶液的 pH 到 7.5±0.05。 0.05mol/L 氢氧化钠按 GB/T601 配制与标定。使用时稀释 10 倍。 10g/L 酚酞指示液：GB/T603 配制。 待测酶液的制备 称取酶样品 1g~2g，精确至 0.0002g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。如果是粉末，可加少量缓冲液研磨再稀释。测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在 1mL~2mL 范围内。 测定 电位滴定法 ①按 pH 计使用说明书进行仪器校正； ②取两个100mL 烧杯，分别作为空白A 和样品B，分别加入底物溶液 4mL 和缓冲液5mL，再于A 中加入95％酒精15.00mL，于 40℃±0.2℃水浴中预热 5min，然后各加 1mL 酶液，立即混匀计时，准确反应 15min 后，于 B 中立即补加 15.00mL 95％ 酒精终止反应，取出。 ③在烧杯中加入一转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，至 pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 指示剂滴定法 ①取两个 100mL 三角瓶，分别作为空白 A 和样品 B，分别加入底物溶液 4mL 和缓冲液 5mL，再于 A 中加入 95％酒精15.00mL，于 40℃±0.2℃水浴中预热 5min，然后各加 1mL 酶液，立即混匀计时，准确反应 15min 后，于 B 中立即补加 15.00mL 95％酒精终止反应，取出。 ②于 A、B 瓶中各酚酞两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持 30s 不退色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 计算 脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算： 式 中 ： X1——样品的酶活力，u/g； V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（ mL）； V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（ mL）； c——氢氧化钠标准溶液，单位为摩尔每升（mol/L） 50——0.05mol/L 氢氧化钠溶液 1.00mL 相当于脂肪酸 50μmol； n——样品的稀释倍数； n 1 0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数； 15——反应时间 15min，以 1min 计算。 4 讨论 影响脂肪酶测定结果有很多因素，其中底物、反应温度和 pH 因素影响最大。 在滴定法中，以前国外有报导测定脂肪酶酶活时，不将底物制成乳化液，直接在搅拌状态下对油脂进行酶解反应， 然后用碱滴定生成的脂肪酸。不乳化测得的结果平行性较差，这可能是反应过程中的随机误差引起的。因为不乳化时， 反应体系是酶的水溶液加入底物橄榄油中，水与油是互不相溶的，必然造成体系的不均匀，酶