蛋白质测定方法.docx

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(microKjeldahlmethod) 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中含有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，普通采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于含有测定精确度高，可测定多个不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的原则分析办法. 实验原理 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中含有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，普通采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于含有测定精确度高，可测定多个不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的原则分析办法。其原理以下： 1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加紧反映，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。 2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸取。 3.滴定：用过量原则HCl吸取NH3，剩余的酸可用原则NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸取的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫批示剂。HCl＋NaOHNaCl+H2O 本法合用于0.2~2.0mg的氮量测定。 1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反映室8.反映室外壳9.夹子10.反映室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网 微量凯氏蒸馏装置示意图 试剂和器材 一、试剂 浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的原则盐酸；原则硫酸铵（0.3mg氮/mL） 催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。 批示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。 二、测试样品 牛血清白蛋白。 三、器材 微量凯氏定氮仪；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）;烧杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角烧瓶150mL（×4）；凯氏烧瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；电炉；分析天平。 操作办法 一、样品解决 称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5mL浓硫酸。 二、消化 将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适宜加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大概维持2~3h。待消化液变成褐色后，为了加速完毕消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1~2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完毕。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶多次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。 三、蒸馏 1.蒸馏器的洗涤 蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反映室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴批示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1~2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。 2.消化样品及空白的蒸馏 取50mL锥形瓶数个，各加25mL0.01M原则HCl和1~2滴批示剂，用表面皿覆盖备用。 取2mL稀释消化液，由小漏斗加入反映室。将一种装有0.01M原则HCl和批示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。 用小量筒量取5mL10MNaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反映室。尚未完全尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反映室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反映生成的NH3逸出被吸取。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以0.01MNaOH原则溶液滴定。记下所耗去的体积。 3.蒸馏后蒸馏器的洗涤 蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度忽然下降，即可将反映室残液吸至收集器。 原则样品的测定 在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用原则硫酸铵试做实验2~3次。 原则硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。 四、计算 样品的含氮量（mg/mL）= 若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质（如血清），则： 样品中蛋白质含量（mg/mL）＝ 式中：A为滴