临床免疫学酶免疫技术.docxVIP

第十章酶免疫技术 本章考点 .酶免疫技术的特点 .酶免疫技术分类 .酶联免疫吸附试验(ELISA) ,膜载体的酶免疫测定 .临床应用 第一节酶免疫技术的特点 酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一 种标记免疫技术。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、 价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中 不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收 高。 一、酶和酶作用的底物 L辣根过氧化酶(HRP) ： HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含 糖量约18%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种口卜 咻蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁口卜麻环，在403nm波 长处有最高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化 物。后者为固体，作为试剂较比。2方便。 许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(TMB) 和ABTS。0PD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而 且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色, 可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS,虽然灵敏度不如0PD和?B,但空白值很低。 .碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD,酶作用 的最适pH为8. 0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为100kD,最适pH为9. 6。一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP) 作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反 应后，黄色可稳定一段时间。 在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯 度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均 采用HRPo .其他的酶：有葡萄糖氧化酶、半乳糖甘酶和服酶等。B-半乳糖甘酸的底物常用4-甲基伞基 半乳糖甘，经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏 感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作 为测定容器，此载体不可发出荧光。胭酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外， 在人体内没有内源酶。 二、酶标记抗体或抗原 酶标记的抗原或抗体称为结合物(conjugate)。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合， 如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。 L戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。 一、生物素-亲和素系统的特点 灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。 二、生物素的理化性质与标记 （-）生物素及其活化 .标记蛋白质氨基的活化生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） .标记蛋白质醛基的活化生物素 酰肿（BHZ）和脱化生物胞素（BCHZ） .标记蛋白质筑基的活化生物素3- （N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB） 4.标记蛋白质核酸的活化生物素 常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核昔三磷 酸、BNHS 和 BHZ。 （二）生物素标记蛋白质 生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质 （如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。 标记方法：（1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多 采用BHZ。（2）标记酶：以生物素标记HRP为例。 标记注意事项：（1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择 相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3） 为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质 结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。 三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记 1.亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。 2,链霉亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。 3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC和胶体金。亲和素的标记（