3种药物对晚孕鼠子宫平滑肌细胞vdccl亚型mrna表达的影响.docxVIP

3种药物对晚孕鼠子宫平滑肌细胞vdccl亚型mrna表达的影响 由于细胞内游离ca2的浓度增加，子宫平滑肌细胞开始收缩并开始生产。但在此过程中,细胞外Ca2+通过细胞膜上电压依赖性钙通道-L亚型(VDCC-L)进入细胞内是发动分娩的关键。而VDCC-L的开放又受其α1、β2亚单位的控制与调节。本研究选用常用的诱发宫缩药物——缩宫素、米索前列醇,及常用的抑制宫缩药物——尼莫地平(VDCC-L的拮抗剂)作用于晚孕鼠,探讨对分娩鼠子宫平滑肌细胞及左心室心肌细胞VDCC-L的功能性α1、β2基因表达的影响。 数据和方法 一、 不同妊娠合并孕鼠的妊娠诱导妊娠 本实验所用Wistar孕鼠由中南大学湘雅医学院试验动物学部提供,分为4组,每组10只。分组如下:(1)自然分娩组:孕22 d分娩时不给任何药物,自然分娩;(2)缩宫素组:孕龄20 d的孕鼠,以缩宫素0.25 mU/L, 5 ml腹腔注射,每日2次,诱导分娩;(3)米索前列醇组:孕龄20 d的孕鼠,以米索前列醇10 mg/L, 5 ml腹腔注射,每日2次,共2日诱导分娩;(4)尼莫地平组:孕龄20 d的孕鼠,以尼莫地平0.2 g/L,5 ml腹腔内注射,每日2次,共2日后自然分娩。以上各组孕鼠平均分娩时间、产仔数比较,差异均无显著性(P0.05)。各组孕鼠分娩2个以上鼠仔时断颈处死,迅速无菌取出子宫体部肌肉及左心室肌肉各0.5 g～2.0 g,编号液氮储藏、待测。 二、 材料和试剂 1. cttcca-3agtgagtg-3agtgagtg-3前因子型各次agtg-3-pas-332和3-pa-52目的片段的鉴定 VDCC-L α1、β2引物由上海生工生物公司合成,序列为:α1:上游3′-AGA AGC AGC AGC TGG AAG AG-5′,下游3′-CAC CAG AGA CTT CCA CAG CA-5′;β2:上游3′-CAT GCG TGT GTG AGT GTG AG-5′,下游3′-AGC AGG GAG TCA GCC ACT AA-5 α1及β2目的片段分别为202 bp和197 bp。内参对照物β-肌动蛋白(β- actin)引物由我院神经内科实验室吴志国博士提供,目的片段320 bp,序列为:上游3′- GTC GTC GAC AAC GGC TCC GG-5′,下游3′- GCC ACA CGC AGC TCA TTG TAG AAG GTG-5′。 2. 药物、药物与药物 Troil购自美国GIBCO公司,逆转录试剂盒及其余试剂均购自美国Promega公司。缩宫素购自上海生化制药厂(10 U/ml),米索前列醇购自英国Searle药厂(200 μg/片),尼莫地平购自德国拜耳公司(10 mg/50 ml)。均用生理盐水配制所需浓度。 三、 方法 1. rna的琼脂糖电泳检测 采用Troil一步法完成,提取组织总RNA,取适量RNA进行1.2%琼脂糖电泳并测定吸光度(A)260、280及320值,确定RNA的质量、浓度和纯度。 2. 逆转录rna 按Promege逆转录试剂盒说明书进行。反应体积20 μl,RNA模板量2 μg,采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA,置-70℃冰箱保存。 3. pcr及taq酶检测 β-肌动蛋白(actin)为内参对照物。取2 μl逆转录产物作模板,反应体积25 μl,每管加入10 pmol/L β- actin 、25pmol/L α1或β2上、下游引物各1 μl、10×PCR缓冲液(不含镁)2.5 μl、25 mmol/L氯化镁1.5 μl、Taq酶0.5 μl,去离子水补至25 μl。反应条件:94℃变性40 s,52℃退火30 s,72℃延伸60 s,α132次循环,β234次循环。 4. 密度的测定 取5 μl PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下检查,与标准相对分子质量比较,确认特异条带,并用Staratagene Eagleeye Ⅱ图像分析仪测定密度,与内对照片段比较,得出目的片段的相对表达量。 四、 统计方法 结果以xˉ±sxˉ±s表示,采用t检验。 结果 一、4 各组均以vbcc-1和iim为单位，进行了子宫平滑肌和心肌细胞的电泳结果 VDCC-L α1mRNA202bp、β2mRNA197bp及内标的β-actin320bp与标准分子相对质量条带清楚(图1)。 二、4 各组索自然妊娠和心肌病的比较 缩宫素组VDCC-L α1mRNA表达量,高于米索前列醇组、自然分娩组及尼莫地平组(P0.05);自然分娩组VDCC β2mRNA的表达量,高于缩宫素组、米索前列醇组及尼莫地平组(P0.05)。 三、4 各组a相对表达量 心肌细胞VDCC-L α1、β2mRNA相对表达量,自然分娩组高于缩宫素组及