常用细胞实验.docxVIP

实验室试剂耗材存放位置 4°存放：500ml瓶装培养基，配制培养基，10ml或50ml离心管装常用胰酶。 -20°存放：500ml瓶装FBS和50ml离心管分装FBS，500ml瓶装胰酶和50ml离心管分装胰 酶，100ml瓶装双抗和1 ml分装双抗，分装抗支原体。 室温存放：500ml瓶装HBSS，棕色瓶装DMSO，100ml瓶装NaHCO3。 柜子或移动车存放：100ml培养基配制瓶，50ml离心管，15ml离心管，1.8ml冻存管，玻璃 移液管，各种规格的细胞瓶、孔板等。 培养基配制 注意：配制培养基前一天需将FBS拿到4°冰箱融化。 不同培养基配制表 血清含量 培养基种类 配制方法 调节pH 10% FBS MEM 90ml MEM+10ml FBS+ 1ml 双抗+20ul 抗支原体 NaHCO3 调 pH 到 7.2 2% FBS MEM 98ml MEM+2ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体 10% FBS DMEM 90ml DMEM+10ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体 2% FBS DMEM 98ml DMEM+2ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体 10% FBS 1640 90ml 1640+10ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体 2% FBS 1640 98ml 1640+2ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体 细胞培养基选择 常用细胞的培养基和培养病毒种类表 细胞种类 培养基 可培养病毒 Hep-2 1640/MEM RSV，肠道病毒，腺病毒等 RD MEM EV71， CA16 等 Vero MEM 麻疹，风疹，汉坦，黄热，埃博拉，西尼罗，基孔肯亚， 尼巴等 Veroslam DMEM 麻疹，风疹等 veroE6 DMEM 水痘，汉坦，新疆出血热，埃博拉，西尼罗，SARS等 MRC5 MEM 水痘，手足口等 BHK21 DMEM 登革热，乙脑，新疆出血热等 C6/36 1640+DMEM 混合 登革热，乙脑等 MDCK DMEM 流感 常用细胞实验操作 注意：做细胞实验前，先进实验室打开生物安全柜或超净工作台紫外和房间紫外，必要时打 开水浴锅，准备好所有实验用品，待紫外照射半小时后进入细胞房操作。 所有枪头，移液管，EP管等均高压灭菌烘干后使用。 结束实验后将培养基等放回冰箱，废气物处理干净，需要高压的进行高压灭菌，打开生物安 全柜或超净工作台紫外和房间紫外待紫外照射半小时后关闭。 细胞复苏 打开水浴锅升温到37°。 从液氮罐内取出一支细胞，在表格上登记好。 用镊子夹住冻存管，在37。水浴锅内轻轻晃动，直至完全融化。 在T25细胞瓶内加入5ml培养基，再吸取融化的细胞液，轻轻滴加入到细胞瓶培养基中。 盖好细胞瓶盖，轻轻将液体晃动均匀，在显微镜下观察细胞数量，放培养箱培养。 第二天，弃去含DMSO的旧培养基，HBSS洗2次，加入新培养基继续培养。 细胞冻存 尽量培养一大批细胞在同一时间冻存，选择生长良好的细胞。准备好室温放置的程序性 降温盒，DMSO (冬天冻住需放水浴锅融化)，冻存管，足够的胰酶，并事先配制20%FBS 的培养基。 酒精棉球消毒后打开细胞瓶盖子，弃旧培养基，HBSS洗1-2次，加入适量胰酶铺匀，放 培养箱消化。 在显微镜下观察，待细胞圆缩，细胞间空隙明显，弃胰酶，加入培养基吹打，直至细胞 全部吹落，成单个分散悬液。 将细胞悬液加入离心管离心，2000rpm,10min。弃上清，加入20%FBS培养基吹打混匀， 计数后，加20%FBS培养基调整细胞浓度到106/ml，最后加入10%DMSO。 分装细胞液到冻存管，每支1-1.5ml。分装完毕转入程序性降温盒，放-80。冻存。过一 天后放入液氮罐冻存。冻存后需取出一支检查细胞整体冻存情况。 细胞传代 打开水浴锅，放入培养基，并将细胞培养瓶，胰酶等放入安全柜，打开紫外照射半小时。 半小时后，打开安全柜照明取出预热的培养基放入安全柜，细胞瓶和试剂瓶口都用酒精 棉球消毒擦拭。 打开盖子，弃旧培养基，HBSS洗1 -2次，加入1 ml胰酶铺匀，放培养箱消化。 在显微镜下观察，待细胞圆缩，细胞间空隙明显，弃胰酶，加入培养基吹打，直至细胞全 部吹落，成单个分散悬液。 按情况将细胞悬液分瓶，放培养箱培养。 常用细胞消化时间表 细胞种类 加胰酶大约消化时间(min) Hep-2 1-3 RD 1-3 Vero 3-10 Veroslam 10-30 veroE6 1-5 MRC5 1-3 BHK21 1-3 C6/36 不加胰酶用培养基轻轻吹下 MDCK 10-30 细胞铺板 取出一瓶长满的细胞，弃旧培养基，HBSS洗1-2次，加入血］胰酶铺匀，放培养箱消化。 在显微镜下观察，待细胞圆缩，细胞间