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hplc法测定锁阳中原儿茶酸的含量 锁阳又名不老药、锈铁棒、地毛球和羊圈拉。这是锁阳科植物锁阳的干燥土壤。具有益肾阳、益血润肠排便的功效。临床上主要用于腰膝酸软、阳虚、滑精、肠干渴等证候，疗效准确。锁阳中含有的原儿茶酸,具有增加冠脉流量、降低心肌耗氧量、体外抑制血小板聚集和抗菌的活性[3~5]。锁阳及其制剂中原儿茶酸的含量测定尚未见文献报道。本文以原儿茶酸为对照品,建立了以高效液相色谱(HPLC)法测定锁阳药材中原儿茶酸含量的方法,结果准确、重现性好,可为控制该药材和饮片的内在质量提供参考依据。 1 材料表面 1.1 高效液相色谱仪检测d-2000 1100高效液相色谱仪,包括G1311A四元泵、G1315A DAD检测器、1100化学工作站(美国Agilent公司);高效液相色谱仪,包括L-6000泵、L-4200H检测器、D-2500数据处理机(日本日立公司);D2025型十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);SB2200-T超声波提取器(上海必能信超声有限公司)。 1.2 测定试剂及仪器 原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:809-200102);乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯;锁阳药材由甘肃省张掖市药品检验所毛晓春副主任药师鉴定为Cynomorium songaricum Rupr.。 2 方法和结果 2.1 理论塔板数测定 色谱柱:Lichrosorb ODS C18(250mm×4.6mm,5m);流动相:乙腈-水-冰醋酸(10∶100∶0.1);检测波长:259nm;流速:1.0mL·min-1;柱温:室温;进样量:10μL。理论塔板数按原儿茶酸峰计算约为6 400。在此色谱条件下,原儿茶酸和前后色谱峰可达到基线分离,拖尾因子为1.06,峰形基本对称,详见图1。 2.2 对照品贮备溶液 精密称定原儿茶酸对照品9.10mg,置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,超声处理10min,放至室温,作为对照品贮备溶液;精密吸取上述对照品贮备溶液5mL,置25mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,超声处理10min,放至室温,作为对照品溶液(每1mL含原儿茶酸36.4μg)。 2.3 水浴浓缩提取液制备 取样品粉末(过3号筛)约1g,精密称定,加水50mL回流提取2次每次1合并提取液水浴浓缩至约10加盐酸调节pH值为3,置分液漏斗中,用乙醚轻轻振摇提取4次(25、25、25、20mL),合并提取液,低温挥干乙醚,残渣用流动相洗至10mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,超声处理10min,放至室温,备用。 2.4 标准曲线及线性回归法考察对照品进样量与峰面积积分值 精密吸取上述对照品贮备溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL(分别含原儿茶酸0.364、0.728、1.092、1.456、1.820mg),分别置于25mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,超声处理10min,放至室温。精密吸取上述5种溶液各10μL,按上述色谱条件,分别进样,测定。以对照品进样量(X,μg)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程:Y=1 064 644.9X+2 584.3(r=0.999 9)。结果表明,原儿茶酸进样量在0.15~0.73μg范围内具有良好的线性关系。 2.5 精密度测试 精密吸取对照品溶液,在上述色谱条件下连续进样6次。结果,原儿茶酸峰面积的RSD=0.55%,表明本方法精密度良好。 2.6 份3.9的测定 取同一批样品(产地:内蒙古阿右旗)6份,按“2.9”项下方法测定。结果,平均含量为0.24mg·g-1,RSD=0.29%,表明本方法重现性好。 2.7 h内平均含量 取“2.6”项下同批样品在4、8、12、24、48h分别测定。结果,24h内平均含量为0.23mg·g-1,RSD=0.38%;48h内平均含量为0.23mg·g-1,RSD=0.56%,表明被测样品在48h内稳定性良好。 2.8 对照品溶液的制备 取已知含量的样品(产地:内蒙古阿右旗,含量:0.24mg·g-1),共6份,每2份为一组,各加入一定量的对照品溶液,按上述方法制备供试品溶液,按“2.9”项下方法测定,结果详见表1。 2.9 锁阳药材和饮片中原儿茶酸含量测定 照供试品溶液制备法制备10批供试品溶液,分别取对照品溶液、供试品溶液,经0.45μm针筒过滤器过滤,精密吸取10μL进样,按外标法计算,被测锁阳药材和饮片中原儿茶酸的含量测定结果详见表2。 3 样品含量测定 在进行系统性试验时从检测器收集到的信息可知原儿茶酸在222、259、293nm波长处均有最大吸收,且在259nm波长处的灵敏度较高,故确定259nm为检测波长。在确定色谱分离条件时,笔者曾对甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-