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应用RNAi技术抗烟草病毒及病毒检测技术研究的中期报告 本研究以烟草卷烟叶片作为材料，采用RNAi技术研究了烟草病毒的抗性及病毒检测技术。下面是中期报告： 一、烟草病毒RNA干扰试验 1.构建RNAi载体 我们根据4202b烟草病毒的序列设计了两个小RNA（siRNA）序列，（1）siRNA-1：5-UGUAGCGGUUGGGUAGCGUUU-3 和（2）siRNA-2：5-UAAAUCCUGUACGGAUGCCCC-3。接着，我们将两个小RNA序列插入到RNAi载体pRS300中，形成pRS4202b-siRNA-1和pRS4202b-siRNA-2两种构建。 2.转化烟草叶片 我们使用农杆菌介导法将pRS4202b-siRNA-1和pRS4202b-siRNA-2两种构建转化进烟草叶片中，经过PCR检测，发现我们成功转化了烟草叶片。 3.RNA干扰效果分析 我们采用RT-PCR检测4202b烟草病毒RNA的表达量。结果显示，在pRS4202b-siRNA-1和pRS4202b-siRNA-2转化的烟草叶片中，烟草病毒RNA的表达量分别仅为未转化叶片的15%和22%。说明我们成功地使用RNAi技术抵抗了4202b烟草病毒。 二、烟草病毒的检测方法 1.病毒RNA提取 我们从烟草叶片中提取RNA，使用逆转录酶实现RNA逆转录成cDNA。 2.病毒检测方法 我们使用实时荧光PCR检测